4.3.1. Методы определения гормонов
В настоящее время наиболее используемыми в клинической практике методами определения гормонов являются:
Радиоимунный,
Иммунорадиометрический,
Радиорецепторный,
Химические методы и другие.
До конца 60-х годов единственным методом определения уровня гормонов был биологический, основной принцип которого заключался в том, что в биологическую систему (животное, орган, ткань) вводится проба, содержащая неизвестное количество гормона и по степени выраженности ответной реакции определяется уровень гормона в ней в биологических единицах действия. Так, пролактин дозозависимо стимулирует рост эпителия зоба голубей, тестостерон стимулирует рост предстательной железы у неполовозрелых и кастрированных крыс.
Радиоиммунный анализ (РИА) определения гормонов основан на конкурентном связывании меченых радиоактивной меткой и немеченых гормонов со специфическими антителами. Гормон выступает в роли антигена. Преимуществами РИА являются высокая чувствительность, высокая специфичность, точность, воспроизводимость и простота выполнения. Недостатком – использование радиоактивных изотопов, что определяет ограниченный срок годности тест–наборов.
Иммунорадиометрический анализ (ИРМА) - это модификация РИА, в которой радиоактивной меткой маркируется не антиген (гормон), а специфические антитела.
Радиорецепторный анализ (РРА) – вместо антител к гормонам используются их собственные рецепторы.
Помимо радиоактивной метки, в качестве маркеров в гормональном анализе могут использоваться ферменты (иммуноферментный анализ ) и люминисцирующие субстанции (люминисцентный анализ ).
С помощью химических методов определяют метаболиты гормонов и их предшественников (например, норадреналина и адреналина, дофамина, серотонина в моче). Определенеие содержания гормонов в крови дает более надежные и точные результаты.
Определение гормонов производят в биопсированном или секционном материале.
4.3.2. Инструментальные методы
Инструментальные методы завершают диагностический поиск при заболевании эндокринных желез. Наиболее часто используют: ультразвуковое исследование (УЗИ), рентгенографию, компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ). Кроме того, применяются специальные методы, такие как ангиография с селективным забором крови, оттекающей от эндокринной железы для определения гормонов, сцинтиграфия (радиоизотопное исследование) щитовидной железы, надпочечников, денситометрия костей.
Ультразвуковое исследование наиболее часто используется в эндокринологии. Принцип метода заключается в том, что датчик с пьезокристаллом посылает ультразвуковые волны в тело человека, а затем воспринимает отраженные импульсы, преобразуя их в электрические сигналы, которые через усилитель попадают на видеомонитор. УЗИ помогает определять размеры и эхоструктуру органа, а также проведение пункционной биопсии органов.
Компьютерная томография основана на получении «среза» тела путем компьютерной обработки данных о поглощающей способности тканей при прохождении через них коллимированного пучка рентгеновских лучей. В компьютерных томографах испускаемый трубкой узкий рентгеновский пучок, проходя через исследуемый слой, улавливается детекторами и обрабатывается. Каждая ткань в зависимости от плотности по разному поглощает излучение. Минимальная величина патологического очага, определяемая с помощью КТ, колеблется от 0,2 до 1 см.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) основана на возможности изменения резонансных и релаксационных процессов в протонах водорода, находящихся в статическом магнитном поле в ответ на применение радиочастотного импульса. После прекращения импульса протоны возвращаются в исходное состояние, «сбрасывая» лишнюю энергию, которая улавливается прибором. Построение изображения осуществляется по разнице энергий из различных точек. МР-томографы позволяют делать срезы толщиной 0,5 – 1 мм. Достоинствами МРТ являются неинвазивность, отсутствие лучевой нагрузки, «прозрачность» костной ткани, высокая дифференциация мягких тканей.
Молекулярно-биологическая диагностика является высокоинформативным методом при диагностике многих эндокринных заболеваний.
Все наследственные заболевания разделяются на три основные группы хромосомные, генные и заболевания с наследственной предрасположенностью.
Для диагностики хромосомных эндокринных заболеваний применяют метод кариотипирования и исследование полового хроматина (синдромы Дауна, Шерешевского-Тернера, Клайфельтера). Для выяснения генных мутаций широко применяют метод составления родословных (генеалогического древа).
Развитие заболеваний с наследственной предраспорложенностью определяется взаимодействием определенных наследственных факторов (мутаций или сочетаний аллелей и факторов внешней среды). Среди заболеваний этой группы наиболее изученными являются аутоиммунные заболевания, такие как сахарный диабет, гипокортицизм, гипо- и гипертиреоз.
Помимо предраспроложенности к заболеванию генотип может определять его прогноз, развитие осложнений, а также прогноз эффективности применяемых методов лечения.
Подходы к обследованию пациентов с эндокринными заболеваниями принципиально не отличаются от принятых в клинике внутренних болезней, при этом необходимо учитывать, что нарушение функции эндокринной железы, как правило, сопровождается изменением со стороны нескольких, а иногда большинства органов и систем. Несмотря на то, что установление диагноза большинства эндокринопатий требует верификации лабораторными или инструментальными методами, доминирующее значение имеют данные анамнеза и физикального исследования.
Среди общих особенностей анамнеза эндокринопатий следует отметить, что за исключением сахарного диабета и ряда других заболеваний, эндокринная патология чаще развивается в относительно молодом возрасте. При нарушении функции большинства эндокринных желез происходит изменение массы тела, внешнего вида, физической активности и половой функции. Так, сам факт беременности и родов на протяжении предполагаемого анамнеза у женщины позволяет с высокой долей вероятности усомниться в наличии у нее тяжелого эндокринного заболевания. Наиболее значимые вопросы, которые необходимо обсудить при сборе анамнеза эндокринного заболевания, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Данные анамнеза, типичные для многих эндокринных заболеваний
Снижение массы тела (часто выраженное)
Прибавка массы тела (редко выраженная) Изменение внешнего вида и психики Нарушение менструального цикла Бесплодие Снижение либидо Эректильная дисфункция Галакторея Нарушение потоотделения (потливость, сухость кожи) Нарушение роста волос (гипертрихоз, повышенное выпадение) Кардиомиопатия (нарушение ритма, сердечная недостаточность) Изменение артериального давления (гипотензия, гипертензия) Нарушение пищевого поведения (анорексия, булимия) Мышечная слабость Переломы костей Задержка роста Семейный анамнез эндокринного заболевания |
Для большинства наиболее распространенных в клинической практике заболеваний семейный анамнез для постановки диагноза имеет ограниченное значение (условным исключением можно считать сахарный диабет 2 типа). Это связано с тем, что большинство эндокринопатий являются не наследуемыми заболеваниями, а патологией с наследственной предрасположенностью.
В детской эндокринологической практике удельный вес наследственных заболеваний существенно выше. Тем не менее ряд наследственных эндокринопатий может впервые манифестировать и у взрослых (синдром множественных эндокринных неоплазий). При многих эндокринных заболеваниях диагноз может быть сочень высокой долей вероятности установлен уже при осмотре пациента (табл. 2).
Таблица 2
Заболевания, диагноз которых часто очевиден при осмотре
Сочетание яркой клинической симптоматики многих эндокринопатий с особенностями психики больных зачастую приводит к тому, что диагностическая концепция у врача зарождается уже при первом взгляде на пациента и опрос ведется активно, поскольку значимые для диагноза жалобы часто не предъявляются больным. Но иногда первое впечатление даже опытного эндокринолога не подтверждается при гормональном исследовании (например, при гипотиреозе).
В диагностике эндокринных заболеваний можно выделить 4 группы типичных ошибок:
1. Игнорирование очевидной клинической симптоматики. Наиболее часто эти ошибки допускаются при синдроме Кушинга и акромегалии, когда медленно развивающиеся клинические проявления воспринимаются как «возрастные» изменения или отдельные симптомы (артериальная гипертензия, ожирение, анемия), либо трактуются как самостоятельные заболевания.
2. Переоценка значимости лабораторных методов исследования. Определение уровня гормонов «на всякий случай» ведет к тому, что лабораторные данные возводятся в абсолютную диагностическую значимость. Очень часто источником ошибок при интерпретации данных гормонального исследования является игнорирование правил забора материала (добавление консерванта, антикоагулянта и проч.), а также несоблюдение самой методики гормонального исследования.
3. Переоценка значимости инструментальных методов исследования. Проведение УЗИ надпочечников или яичников, компьютерной или магнитно-резонансной томографии надпочечников или головы без анализа клинической картины и определения уровня необходимых гормонов часто служит неверным основанием для заключения о наличии патологии соответствующих органов. При этом варианты анатомического строения или несущественные отклонения от нормы также считаются прямым указанием на патологический процесс и приводят к постановке диагноза несуществующего заболевания.
4. Упорный поиск эндокринной патологии. У лиц с конституциональными особенностями обмена веществ, астеническими проявлениями, вегетативными расстройствами, алиментарными нарушениями, при злоупотреблении медикаментами, неврозах и других психических расстройствах нередко ведется настойчивый поиск эндокринных заболеваний. Ситуацию ухудшает бессистемное проведение большого числа гормональных и инструментальных исследований, у многих таких пациентов удается выявить какие-то клинически незначимые сдвиги, которые патогенетически не связаны с основным заболеванием.
Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.Ф.
Методы исследования желез внутренней секреции
Для изучения эндокринной функции органов, в том числе и желез внутренней секреции, применяются следующие методы:
Экстирпации желёз внутренней секреции (эндокринных).
Избирательное разрушение или подавление инкреторных клеток в организме.
Трансплантация эндокринных желез.
Введение экстрактов эндокринной железы интактным животным или после удаления соответствующей железы.
Введение химически чистых гормонов интактным животным или после удаления соответствующей железы (заместительная «терапия»).
Химический анализ экстрактов и синтез гормональных препаратов.
Методы гистологического и гистохимического исследования эндокринных тканей
Метод парабиоза или создания общего кровообращения.
Метод введения в организм «меченых соединений» (например, радиоактивными нуклидами, флюоресцентов).
Сравнение физиологической активности крови, притекающей к органу и оттекающей от него. Позволяет выявить секрецию в кровь биологически активных метаболитов и гормонов.
Исследование содержания гормонов в крови и моче.
Исследование содержания предшественников синтеза и метаболитов гормонов в крови и моче.
Исследование больных с недостаточной или избыточной функцией железы.
Методы генной инженерии.
Метод экстирпации
Экстирпация - хирургическое вмешательство, заключающееся в удалении структурного образования, например, железы.
Экстирпация (extirpatio) от латинского extirpo, extirpare - искоренять.
Различают частичную и полную экстирпацию.
После экстирпации изучают различными методами сохранившиеся функции организма.
С помощью этого метода были открыты инкреторная функция поджелудочной железы и её роль в развитии сахарного диабета, роль гипофиза в регуляции роста тела, значимость коры надпочечников и др.
Предположение о наличии эндокринных функций у поджелудочной железы нашло подтверждение в опытах И.Меринга и О.Минковского (1889 г.), показавших, что её удаление у собак приводит к выраженной гипергликемии и глюкозурии. Животные погибали в течение 2 – 3 недель после операции на фоне явлений тяжелого сахарного диабета. В последующем было установлено, что эти изменения возникают из за недостатка инсулина - гормона, образующегося в островковом аппарате поджелудочной железы.
С экстирпацией эндокринных желёз у человека приходится сталкиваться в клинике. Экстирпация железы может быть преднамеренная (например, при раке щитовидной железы орган удаляется полностью) или случайная (например, при удалении щитовидной железы удаляются паращитовидные железы).
Метод избирательного разрушения или подавления инкреторных клеток в организме
Если удаляется орган, который содержит клетки (ткани), выполняющие разные функции, дифференцировать физиологические процессы, выполняемые этими структурами трудно, а иногда вообще не возможно.
Например, при удалении поджелудочной железы, организм лишается не только клеток, вырабатывающих инсулин ( клетки), но и клеток, вырабатывающих глюкагон ( клетки), соматостатин ( клетки), гастрин (G клетки), панкреатический полипептид (ПП клетки). Кроме того, организм лишается важного экзокринного органа, обеспечивающего процессы пищеварения.
Как понять какие клетки ответственны за ту или иную функцию? В этом случае можно попытаться избирательно (селективно) повредить какие либо клетки и определить недостающую функцию.
Так при введении аллоксана (уреида мезоксалевой кислоты), происходит избирательный некроз клеток островков Лангерганса, что позволяет изучать последствия нарушения продукции инсулина без изменения других функций поджелудочной железы. Производное оксихинолина - дитизон вмешивается в метаболизм клеток, образует комплекс с цинком, что также нарушает их инкреторную функцию.
Второй пример - избирательное повреждение фолликулярных клеток щитовидной железы ионизирующим излучением радиоактивного йода (131I, 132I). При использовании этого принципа в лечебных целях говорят о селективной струмэктомии, в то время как хирургическую экстирпацию с теми же целями называют тотальной, субтотальной.
К этому же типу методов можно отнести и наблюдение за больными с повреждением клеток в результате иммунной агрессии или аутоагрессии, применение химических (лекарственых) средств, угнетающих синтез гормонов. Например: антитиреоидных средств - мерказолила, попилтиоурацила.
Метод трансплантации эндокринных желез
Пересадка железы может производиться тому же животному после ее предварительного удаления (аутотрансплантация) или интактным животным. В последнем случае применяется гомо- и гетеротрансплантация .
В 1849 году немецкий физиолог Адольф Бертольд установил, что пересадка кастрированному петуху в брюшную полость семенников другого петуха приводит к восстановлению исходных свойств у кастрата. Эту дату считают датой рождения эндокринологии.
В конце XIX века Штейнах показал, что пересадка половых желез морским свинкам и крысам меняет их поведение и продолжительность жизни.
В 20-х годах нашего столетия пересадка половых желез с целью «омоложения» применил Броун-Секар и широко использовал русский ученый С.Воронцов в Париже. Эти опыты трансплантации дали богатый фактический материал о биологических эффектах гормонов половых желез.
У животного с удаленной эндокринной железой можно ее имплантировать заново в хорошо васкуляризированную область тела, например под капсулу почки или в переднюю камеру глаза. Такая операция называется реимплантацией.
Метод введения гормонов
Может вводиться экстракт эндокринной железы или химически чистые гормоны. Гормоны вводят интактным животным или после удаления соответствующей железы (заместительная «терапия»).
В 1889 г. 72 летний Броун Секар сообщил об опытах, проведенных на самом себе. Вытяжки из семенников животных оказали на организм учёного омолаживающее действие.
Благодаря применению метода введения экстрактов эндокринной железы было установлено наличие инсулина и соматотропина, тиреоидных гормонов и паратгормона, кортикостероидов и др.
Разновидностью метода является кормление животных сухой железой или препаратами, приготовленными из тканей.
Использование чистых гормональных препаратов позволило установить их биологические эффекты. Нарушения, возникшие после хирургического удаления эндокринной железы, могут быть откорректированы посредством введения в организм достаточного количества экстракта данной железы или индивидуального гормона.
Применение этих методов у интактных животных привело к проявлению обратной связи в регуляции эндокринных органов, т.к. создаваемый искусственный избыток гормона вызывал подавление секреции эндокринного органа и даже атрофию железы.
Химический анализ экстрактов и синтез гормональных препаратов
Производя химический структурный анализ экстрактов из эндокринной ткани, удалось установить химическую природу и идентифицировать гормоны эндокринных органов, что в последующем привело к получению искусственным путем эффективных гормональных препаратов для исследовательских и лечебных целей.
Метод парабиоза
Не путайте с парабиозом Н.Е.Введенского. В этом случае речь идёт о явлении. Мы будем говорить о методе при котором используется перекрёстное кровообращение у двух организмов. Парабионты - организмы (два или более) имеющие связь между собой через кровеносную и лимфатическую систему. Такая связь может иметь место в природе, например у сросшихся близнецов, или создаётся искусственно (в эксперименте).
Метод позволяет оценить роль гуморальных факторов в изменении функций интактного организма одной особи при вмешательстве в эндокринную систему другой особи.
Особенно важными являются исследования сросшихся близнецов, имеющих общее кровообращение, но раздельные нервные системы. У одной из двух сросшихся сестер описан случай беременности и родов, после чего лактация наступила у обеих сестер, и кормление было возможно из четырех молочных желез.
Радионуклидные методы
(метод меченых веществ и соединений)
Заметьте не радиоактивных изотопов, а веществ или соединений, меченных радионуклидами. Строго говоря вводятся радиофармпрепараты (РФП) = носитель+ метка (радионуклид).
Этот метод позволяет изучать процессы синтеза гормонов в эндокринной ткани, депонирование и распределение гормонов в организме, пути их выведения.
Радионуклидные методы принято делить на in vivo и in vitro исследования. При in vivo исследованиях различают in vivo и in vitro измерения.
Прежде всего все методы можно разделить на in vitro - и in vivo -исследования (методы, диагностику)
In vitro-исследования
Не следует путать in vitro - и in vivo -исследования (методы) с понятием in vitro - и in vivo -измерения .
При in vivo – измерениях всегда будет in vivo исследования. Т.е. нельзя измерить в организме, то, чего не было (вещество, параметр) или не ввели в качестве тестирующего агента при исследовании.
Если ввели в организм тестирующее вещество, затем взяли биопробу и провели in vitro – измерения, исследование всё равно следует обозначить как in vivo – исследование.
Если тестирующее вещество в организм не вводили, а взяли биопробу и провели in vitro – измерения, с введением или без введения тестирующего вещества (реактива например) исследование следует обозначить как in vitro – исследование.
В радионуклидной in vivo диагностике чаще используется захват РФП из крови инкреторными клетками и включается в образующиеся гормоны пропорционально интенсивности их синтеза.
Примером использования этого метода является изучение щитовидной железы с помощью радиоактивного йода (131I) или пертехнетата натрия (Na99mTcO4), коры надпочечников с помощью меченного предшественника стероидных гормонов, чаще всего холестерина (131I холестерола).
При радионуклидных in vivo исследованиях проводят радиометрию или гамма топографию (сцинтиграфию). Радионуклидное сканирование как метод устарело.
Раздельная оценка неорганической и органической фаз внутритиреодного этапа йодного обмена.
При изучении контуров самоуправления гормональной регуляции при in vivo исследованиях применяют тесты стимуляции и подавления.
Решим две задачи.
Для определения характера пальпируемого образования в правой доле щитовидной железы (рис.1) провели сцинтиграфию по 131I (рис.2).
Рис.1 |
Рис.2 |
Рис.3 |
Через некоторое время после введения гормона сцинтиграфию повторили (рис.3). Накопление 131I в правой доле не изменилось, в левой – появилось. Какое исследование проведено пациенту, с каким гормоном? Сделайте вывод по результатам исследования.
Вторая задача.
Рис.1 |
Рис.2 |
Рис.3 |
Для определения характера пальпируемого образования в правой доле щитовидной железы (рис.1) провели сцинтиграфию по 131I (рис.2). Через некоторое время после введения гормона сцинтиграфию повторили (рис.3). Накопление 131I в правой доле не изменилось, в левой – исчезло. Какое исследование проведено пациенту, с каким гормоном? Сделайте вывод по результатам исследования.
Для изучения мест связывания, накопления и метаболизма гормонов, их метят с помощью радиоактивных атомов, вводят в организм и применяют ауторадиографию. Срезы изучаемых тканей помещают на радиочувствительный фотоматериал, типа рентгеновской пленки, проявляют и места затемнения сравнивают с фотографиями гистологических срезов.
Исследование содержания гормонов в биопробах
Чаще в качестве биопроб используется кровь (плазма, сыворотка) и моча.
Этот метод является одним из наиболее точных для оценки секреторной деятельности эндокринных органов и тканей, но он не дает характеристики биологической активности и степени гормональных эффектов в тканях.
Используются различные методики исследования в зависимости от химической природы гормонов, в том числе биохимические, хроматографические и биологические методики тестирования, и опять же радионуклидные методики.
Среди радионуклидных медодов различают
радиоиммунный (РИА)
иммунорадиометрический (ИРМА)
радиорецепторный (РРА)
В 1977 г. Розалин Ялоу получила Нобелевскую премию за усовершенствование методов радиоиммунологического исследования (RIA) пептидных гормонов.
Радиоиммунный анализ, получивший сегодня наибольшее распространение ввиду высокой чувствительности, точности и простоты, основан на применении меченных изотопами йода (125I) или тритием (3H) гормонов и связывающих их специфических антител.
Зачем он нужен?
Много сахара крови У большинства больных сахарным диабетом инсулиновая активность крови снижена редко, чаще она нормальная или даже повышена
Второй пример гипокальциемия. Часто паратирин повышен.
Радионуклидные методы позволяют определять фракции (свободные, связанные с белками) гормонов.
При радиорецепторном анализе, чувствительность которого ниже, а информативность выше, чем радиоиммунного, оценивается связывание гормона не с антителами к нему, а со специфическими гормональными рецепторами клеточных мембран или цитозоля.
При изучении контуров самоуправления гормональной регуляции при in vitro исследованиях применяют определение полного «набора» гармонов различных уровней регуляции, связанных с исследуемым процессом (либеринов и статинов, тропинов, эффекторных гормонов). Например, для щитовидной железы тиролиберина, тиротропина, трийодтирозина, тироксина.
Гипотиреоз первичный:
Т3, Т4, ТТГ, ТЛ
Гипотиреоз вторичный:
Т3, Т4, ТТГ, ТЛ
Гипотиреоз третичный:
Т3, Т4, ТТГ, ТЛ
Относительная специфичность регуляции: введение йода и диойдтирозина угнетает продукцию тиротропина.
Сравнение физиологической активности крови, притекающей к органу и оттекающей от него, позволяет выявить секрецию в кровь биологически активных метаболитов и гормонов.
Исследование содержания предшественников синтеза и метаболитов гормонов в крови и моче
Нередко гормональный эффект в значительной степени определяется активными метаболитами гормона. В других случаях предшественники синтеза и метаболиты, концентрация которых пропорциональна уровням гормона, более доступны для исследования. Метод позволяет не только оценить гормонопродуцирующую активность эндокринной ткани, но и выявить особенности метаболизма гормонов.
Наблюдение за больными с нарушенной функцией инкреторных органов
Это может дать ценную информацию о физиологических эффектах и роли гормонов эндокринной железы.
Аддисон Т. (Addison Tomas), английский врач (1793-1860). Его называют отцом эндокринологии. Почему? В 1855 г. он опубликовал монографию, содержащую в частности, классическое описание хронической надпочечниковой недостаточности. Вскоре её предложили называть аддисоновой болезнью. Причиной аддисоновой болезни чаще всего является первичное поражение коры надпочечников аутоиммунным процессом (идиопатическая аддисонова болезнь) и туберкулёзом.
Методы гистологического и гистохимического исследования эндокринных тканей
Эти методы позволяет оценить не только структурные, но и функциональные характеристики клеток, в частности, интенсивность образования, накопления и выведения гормонов. Например, явления нейросекреции гипоталамических нейронов, эндокринная функция кардиомиоцитов предсердий были обнаружены с помощью гистохимических методов.
Методы генной инженерии
Эти методы реконструкции генетического аппарата клетки позволяют не только исследовать механизмы синтеза гормонов, но и активно вмешаться в них. Механизмы особенно перспективны для практического применения в случаях стойкого нарушения синтеза гормонов, как это случается при сахарном диабете.
Примером экспериментального использования метода может служить исследование французских ученых, которые в 1983 году осуществили пересадку в печень крысы гена, контролирующего синтез инсулина. Внедрение этого гена в ядра клеток печени крысы привело к тому, что в течение месяца клетки печени синтезировали инсулин.
Федеральное агентство по образованию РФ
ГОУ ВПО Башкирский государственный университет
Биологический факультет
Кафедра биохимии
Курсовая
работа
Методы
исследования эндокринной
системы в норме
и патологии
Выполнил:
Студент
ОЗО 5 курса
Группы
А
Усачёв
С. А.
Уфа 2010
Содержание
Введение………………………………………………………… ………………4
1. Обзор
методов исследования эндокринной
системы
в норме и патологии……………………………………………………… …6
1.1. Краткий исторический очерк…………………………………………...6
1.2. Обзор современных методов исследования
эндокринной системы..12
1.3. Современные методы исследования эндокринной
системы на
примере исследования щитовидной железы………………………………28
2. Проблемы
и перспективы методов исследования
эндокринной
системы…………………………………………………………… …………45
Заключение…………………………………………………… ………………..58
Список
использованной литературы…………………………………………59
Список сокращений, принятых в работе
АОК – антителобразующие клетки
АГ – антиген
АКТГ – адренокортикотропный гормон
ВЭЖХ – высокоскоростная жидкостная хроматография
ГИ – компенсаторная гиперинсулинемия
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖХ – жидкостная хроматография
ИФА – иммуноферментный анализ
ИР – инсулинорезистентность
КТ – компьютерная томография
ЛГ – лютеинезирующий гормон
МС – метаболический синдром
МРТ – магнитно-резонансная томография
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РИА – радиоиммунный анализ
РГЗТ – реакция гиперчувствительности замедленного типа
СД 2 – сахарный диабет 2-го типа
TSH – стимулирующий гормон щитовидной железы
Т4 – тироксин
Т3 – трийодтиронин
TBG – тест тироксин-связующего глобулина
УЗИ – ультразвуковое исследование
ФИА – флуоресцентный иммуноанализ
ЦДК – цветное доплеровское картирование
ЦНС – центральная нервная система
ЩЖ – щитовидная железа
Введение
За последние
несколько лет в результате разработки
более тонких, чувствительных и специфических
методов определения гормонов и
других методов изучения эндокринной
системы в норме и патологии клиническая
эндокринология и биохимия во многом превратилась
из своего рода искусства в раздел прикладной
химии, физиологии, физики и генетики.
Этот прогресс оказался возможным благодаря
внедрению в практику большого числа новейших
и высокотехнологичных методов исследования
эндокринной системы, выделению и последующей
биологической и биохимической характеристике
различных высокоочищенных полипептидных
гормонов, стероидов, витаминов, производных
небольших полипептидов и аминокислот,
которые относят к гормонам, а также получению
меченных радиоактивными атомами гормонов
с высокой удельной активностью.
Актуальность
темы:
В настоящее
время, на пороге познания самых скрытых
и загадочных явлений живого организма,
стоит важнейшая задача - найти
наиболее достоверные, доступные и
высокотехнологические методы исследования.
Новая эра нанотехнологий и узкоспециализированных
открытий начинает вносить свою лепту
и в биологическую химию, которая
уже давно использует методы не только
химического анализа, но самые современные
технологии всех разделов физики, информатики,
математики и других наук. Время
диктует свои условия человечеству
– познать глубже, познать досконально,
найти причину процессов, происходящих
в живом организме в норме
и патологии. Поиск новых методов
исследования не останавливается, и
научный работник просто не успевает
обобщить, систематизировать эту
область познания, выделить то, что
ему необходимо в данный момент.
К тому же при изучении мною проблемы
исследований эндокринной системы,
я не нашёл достаточно полного, обобщающего
пособия на эту тему. многие исследователи,
в частности биохимики, сталкиваются с
такой проблемой, как поиск и систематизация
современных методов исследования эндокринной
системы в норме и патологии. Это связано,
прежде всего с тем, что ежедневно появляются
новые источники литературы, новые методы
исследования, но нет ни одного руководства
по методам исследования, которое бы систематизировало
данные о методах. Именно по этим причинам
актуальность выбранной мною темы очень
высока.
Цель
работы:
Систематизировать
данные о состоянии методов исследования
эндокринной системы в норме и патологии
в современном мире.
Задачи:
- Сделать исторический
обзор по теме.
Отразить современное знание о методах исследования эндокринной системы, без подробного описания методики и техники исследований.
Описать методы исследования на примере одной эндокринной железы.
Выделить проблемы и перспективы современных методов исследования эндокринной системы в норме и патологии.
1. Обзор методов исследования эндокринной системы в норме и патологии
1.1. Краткий исторический очерк
Изучение эндокринной системы и сама эндокринология являются относительно новыми явлениями в истории науки. Эндокринная система была недосягаемой частью организма человека вплоть до начала 20 века. До этого исследователи не могли разгадать тайны эндокринных образований ввиду того, что не могли выделить и изучить выделяемые ими жидкости («соки» или «секреты»). Учёные не обнаруживали ни «соков», ни специальных выводных протоков, по которым произведённая жидкость обычно вытекает наружу. Поэтому единственным методом исследования функций эндокринной железы был метод иссечения части или целого органа.
Учёные – историки утверждали, что об органах эндокринной системы на Востоке знали ещё в глубокой древности и почтительно величали их «железами судьбы». По мнению восточных врачевателей, эти железы являлись приёмниками и трансформаторами космической энергии, вливающейся в невидимые каналы (чакры) и поддерживающей жизненные силы человека. Считалось, что слаженную работу «желёз судьбы» могут расстроить катастрофы, происходящие по воле злого рока.
Упоминание о заболевании, скорее всего сахарном диабете, содержится в египетских папирусах 1500 г. до н. э.. Зоб и эффекты кастрации животных и человека принадлежат к первым клиническим описаниям болезней, эндокринная природа которых была доказана впоследствии. Старые клинические описания эндокринных заболеваний были сделаны не только на Западе, но и древнем Китае и Индии.
Если расположить значительные открытия во многих областях эндокринологии по времени, то полученная картина отразит в миниатюре историю всей биологии и медицины. После отрывочных клинических наблюдений, сделанных в древности и средневековье, эти науки прогрессировали крайне медленно. Во второй половине 19 века произошёл быстрый скачок в развитии многих областей медицины, как в отношении качества клинических исследований, так и в понимании механизмов заболеваний. Этот процесс был обусловлен сложностью взаимосвязью исторических причин.
Во-первых, промышленная революция привела к накоплению капиталов, которые использовались для развития многих наук, главным образом химии и биологии.
Другая революция, свершившаяся во второй половине 19 века и имевшая фундаментальное значение для развития не только эндокринологии, но и медицины и биологии, состояла в появлении экспериментального моделирования на животных. Клод Бернар и Оскар Минковский продемонстрировали возможность проведения контролируемых и воспроизводимых опытов в лабораторных условиях. Иными словами, была создана возможность «перекрёстного допроса» природы. Без деятельности этих первооткрывателей мы бы были лишены большей части современных знаний в области эндокринологии. Изучение всех тех веществ, которые называются гормонами, начиналось с опытов на целых животных (а часто и предшествовавших им наблюдений над больными людьми). Эти вещества именовались веществом «Х» или фактором «?». Постулаты « Коха» для эндокринологии предусматривали следующий порядок работы:
1. Удаление предполагаемой железы. После удаления какой-либо эндокринной железы возникает комплекс расстройств, обусловленных выпадением регуляторных эффектов тех гормонов, которые вырабатываются в этой железе. Вследствие травматичности оперативного вмешательства вместо хирургического удаления эндокринной железы может быть использовано введение химических веществ, нарушающих их гормональную функцию. Например, введение животным аллоксана нарушает функцию?-клеток поджелудочной железы, что приводит к развитию сахарного диабета, проявления которого практически идентичны расстройствам, наблюдаемым после экстирпации поджелудочной железы. 1
2. Описание биологических эффектов операции. Например, предположение о наличии эндокринных функций у поджелудочной железы нашло подтверждение в опытах И. Меринга и О. Минковского (1889), показавших, что ее удаление у собак приводит к выраженной гипергликемии и глюкозурии; животные погибали в течение 2-3 нед. после операции на фоне явлений тяжелого сахарного диабета. В последующем было установлено, что эти изменения возникают из-за недостатка инсулина - гормона, образующегося в островковом аппарате поджелудочной железы.
3. Введение экстракта железы.
4. Доказательство того, что введение экстракта ликвидирует симптомы отсутствия железы.
5. Выделение, очистка и идентификация активного начала.
В период второй мировой войны в области эндокринологии было накоплено большое количество данных, многие из которых имели фундаментальное значение для последующего развития науки. После же войны в связи с появлением множества новых методик произошло вообще беспрецедентное ускорение темпа исследований. И в настоящее время в результате резкого притока технических и творческих сил количество публикаций, как по эндокринологии, так и по всем другим аспектам медико-биологических знаний растёт с впечатляющей быстротой. Это означает постоянное поступление новых данных, что требует периодического пересмотра старых представлений в их свете. 2
XX век ознаменовался рождением науки о гормонах, или эндокринологии. Само слово «гормон» было введено в 1905 г. британским физиологом, профессором Эрнстом Старлингом на лекции в Королевском колледже медиков в Лондоне. Оно было образовано двумя профессорами Кембриджского университета от греческого слова hormao, что значит «быстро приводить в действие», «поднимать» или «возбуждать». Старлинг использовал его для описания «химических носителей», выбрасываемых в кровь железами внутренней секреции, или эндокринными железами (endon - внутренний + krino - вырабатывать), например, семенниками, надпочечниками и щитовидной железой, а также из внешних, экзокринных (exo - внешний) желез, таких как слюнные и слезные железы. Эта новая наука очень быстро развивалась, возбуждая умы не только медиков, но и общества.
Как правило, история изучения любого гормона проходит четыре стадии.
Сначала наблюдается эффект, который производит на организм секрет, выделяемый железой.
Во-вторых, разрабатываются методы определения внутреннего секрета и степени его влияния на организм. Сначала это делается посредством биологических анализов с целью определения влияния гормона на организм, в котором его не хватает. Позже устанавливаются химические методы такого измерения.
В-третьих, гормон выделяют из железы и изолируют.
И наконец, в-четвертых, его структуру определяют химики, и его синтезируют. 3
В настоящее время у исследователей, начинающих с наблюдений на уровне целостного организма, по мере продвижения работы возникает всё больше и больше вопросов до тех пор, пока они не пытаются решить исходную проблему на молекулярном уровне. Здесь в свои руки эндокринологическое исследование берёт биологическая химия и её раздел – молекулярная биология (эндокринология).
Как только появляются новые морфологические, химические, электрофизиологические, иммунологические и другие методики, они находят очень быстрое применение в эндокринологии. Например, в 30 – 40х годах для изучения стероидов применялись весьма сложные методы. Это обусловило большие успехи в понимании структуры и биосинтеза стероидных гормонов. Возможность использования радиоактивных изотопов, появившаяся в конце 40 - 50х годов, расширила наши знания о многих аспектах йодного цикла, промежуточного обмена, транспорта ионов и т. д. Для исследования функциональной активности эндокринной железы, может быть использована ее способность захватывать из крови и накапливать определенное соединение. Известно, например, что щитовидная железа активно поглощает йод, который затем используется для синтеза тироксина и трийодтиронина. При гиперфункции щитовидной железы накопление йода усиливается, при гипофункции наблюдается обратный эффект. Интенсивность накопления йода может быть определена путем введения в организм радиоактивного изотопа 131I с последующей оценкой радиоактивности щитовидной железы. В качестве радиоактивной метки могут быть введены также соединения, которые используются для синтеза эндогенных гормонов и включаются в их структуру. В последующем можно определить радиоактивность различных органов и тканей и оценить, таким образом, распределение гормона в организме, а также найти его органы-мишени.
Позднее для изучения многих белков, в том числе гормональных рецепторов, было творчески использовано сочетание электрофореза в поликриламидном геле с радиоавтографией. Одновременно с этими впечатляющими успехами в химии ещё более плодотворным оказалось применение гистохимических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических методов.
Все варианты хроматографии – колоночная, тонкослойная, бумажная, многомерная, газо-жидкостная (с масс-спектрометрией или без неё), высокоэффективная жидкостная – использовались эндокринологами тотчас же после их появления. Они позволили получить важные сведения не только об аминокислотной последовательности пептидов и белков, но и о липидах (особенно простагландинах и близких к ним веществах), углеводах и аминах.
По мере разработки молекулярно-биологических методов исследования эндокринологи быстро применяют их для изучения механизмов действия гормонов. В настоящее время метод рекомбинантных ДНК используется не только для этой цели, но и для производства белковых гормонов. Действительно, трудно назвать биохимический или физиологический метод, который не был бы взят на вооружение эндокринологами. 4
1.2. Обзор современных методов исследования эндокринной системы
При обследовании больных с подозрением на эндокринную патологию, кроме сбора анамнеза заболевания, осмотра и жалоб больного, используют следующие методы диагностики: общие лабораторные методы (клинические и биохимические), гормональное исследование, инструментальные методы, молекулярно-генетические методы.
В большинстве случаев гормональное исследование имеет не ключевое, а верифицирующее значение для постановки диагноза. Для постановки диагноза ряда эндокринных заболеваний гормональное исследование вообще не используется (несахарный и сахарный диабет); в ряде же случаев гормональное исследование имеет диагностическое значение только в комплексе с биохимическими показателями (уровень кальция при гипертиреозе).
При гормональном исследовании может быть выявлено снижение продукции того или иного гормона, повышение и его нормальный уровень (таб.1). Наиболее часто используемыми в клинической практике методами определения гормонов являются различные модификации радиоиммунного метода . Эти методы основаны на том, что меченный радиоактивной меткой гормон и гормон, содержащийся в исследуемом материале, конкурируют между собой за связывание со специфическими антителами: чем больше в биологическом материале содержится данного гормона, тем меньше свяжется меченых молекул гормона, так как количество гормонсвязывающих участков в образце постоянно. Более 20 лет назад Berson и Yalow предложили радиоиммунологический метод определения инсулина.
Этот метод основывался на их наблюдении, согласно которому в периферической крови больных диабетом, получавших инсулин, присутствует белок (который, как было показано позднее, является глобулином), связывающий инсулин, меченный 131I. Значение этих данных и последующей разработки радиоиммунологического метода определения инсулина подчеркивается присуждением Yalow и Berson нобелевской премии.
Вскоре после первых сообщений этих исследователей другими лабораториями были разработаны и описаны соответствующие методы для определения других гормонов. В этих методах применяются либо антитела, либо сывороточные белки, связывающие определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную меткугормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормоном, присутствующим в биологической пробе.
Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина - в цитозоле и ядрах. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продолжает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что антитела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.
Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального анализа. Обычно получают ткань специфического для данного гормона органамишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембраны в осадке при хранении в условиях температуры менее - 20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазматических мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, оказываются нестабильными, что проявляется снижением их способности связывать специфические гормоны, даже если они хранились в замороженном виде, сравнительно недолго.
В последнее время наибольшее распространение получили нерадиоактивные методики. В качестве стандартного метода определения различных соединений в клинической химии все большее распространение получает иммуноанализ , отличающийся хорошей чувствительностью, специфичностью и широкой сферой применения. В частности, иммуноанализ применяют для определения гормонов. К числу таких методов относятся:
- 1) иммуноферментный
анализ (ИФА), твердофазный ИФА типа ELISA
или гомогенный ИФА типа EMIT.
- 2) флуоресцентный
иммуноанализ (ФИА), базирующийся на измерении
усиления, гашения или поляризации флуоресценции
или на изучении флуоресценции с разрешением
во времени.
- 3) био-
или хемилюминесцентный иммуноанализ.
1) быть применимой как для двухсайтового иммунометрического анализа белков, так и для прямых конкурентных анализов гаптенов, основанных на принципе связывания.
2) иметь соответствующие чувствительность, точность и рабочий диапазон определяемых концентраций с минимальным разбросом результатов во всем диапазоне.
3) легко совершенствоваться с целью дальнейшего повышения чувствительности и упрощения анализа.
Потенциально в методике должна быть заложена возможность ее усовершенствования и применения к анализам других веществ, внелабораторным и безразделительным анализам и к одновременному определению нескольких веществ (так называемому множественному иммуноанализу). Идеальным методам иммуноанализа, в наибольшей степени, соответствуют люминесцентные или фотоэмиссионные методы, в которых детекция метки проводится по регистрации излучения света.
Люминесценция - это эмиссия света веществом, находящимся в электронно-возбужденном состоянии. Существуют несколько типов люминесценции, различающихся только источниками энергии, которая переводит электроны в возбужденное состояние, т.е. на более высокий энергетический уровень, а именно:
1) Радиалюминесценция, в которой возбуждение соответствующего флуорофора достигается за счет поглощения энергии, выделяющейся в процессе необратимого радиоактивного распада. Возбужденный флуорофор излучает свет, возвращаясь в основное состояние.
2) Хемилюминесценция, в которой возбуждение достигается в результате химической реакции (обычно необратимой реакции окисления). Если химическая реакция осуществляется в биологических системах под действием ферментов, то в этом случае обычно употребляют термин биолюминесценция. Если химическая реакция инициируется повышением температуры реагентов, то такой тип люминесценции называют термохемилюминесценцией, если же реакцию инициирует электрический потенциал, то соответствующее явление называют электрохемилюминесценцией.
3) Фотолюминесценция, в которой возбуждение вызывают фотоны инфракрасного, видимого или ультрафиолетового света. Фотолюминесценцию можно далее подразделить на флуоресценцию, когда возбужденная молекула быстро возвращается в исходное состояние через синглетное состояние, и фосфоресценцию, когда возбужденная молекула возвращается в исходное состояние через триплетное состояние. Эмиссия фосфоресценции затухает намного медленнее. Испускаемые кванты света имеют большую длину волны. Фотолюминесценция отличается от радио- и хемилюминесценции тем, что она обычно обратима, и поэтому в данной системе ее можно индуцировать повторно (поскольку образование возбужденного интермедиата и последующая его инактивация путем эмиссии света не приводят к химическим превращениям).
Кроме этих методов, своё значение полностью не потеряли химические методы определения ряда веществ (обычно это метаболиты гормонов и их предшественников). Для очистки белковых фракций и изучения гормонов часто используют хроматографию . Жидкостная хроматография находит широкое применение в качестве экспрессного и селективного аналитического метода при разделении и идентификации различных веществ. Жидкостная хроматография (ЖХ) в ее классическом варианте (при атмосферном давлении) и высокоскоростная, или ВЭЖХ при повышенном давлении - оптимальный метод анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью, что объясняется особой ролью подвижной фазы: в отличие от газообразной элюент в ЖХ выполняет не только транспортную функцию. Природа и строение компонентов подвижной фазы контролируют хроматографическое поведение разделяемых веществ. Среди наиболее типичных объектов жидкостной хроматографии белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, красители, полисахариды, взрывчатые вещества, лекарственные препараты, метаболиты растений и животных. Жидкостная хроматография, в свою очередь, разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита. Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая. В основе этого варианта ЖХ лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам. В эксклюзионной (от англ. exclusion - исключение; устаревшее название - ситовая) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, а неподвижная - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля). Если молекулам анализируемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Молекулы или ионы, размеры которых находятся между максимальным и минимальным диаметром пор геля, разделяются на отдельные зоны. Особенно интенсивное развитие эксклюзионная хроматография получила в последние два десятилетия, чему способствовало внедрение в химическую и биохимическую практику сефадексов - декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином. На различных типах сефадексов можно фракционировать химические вещества с различными молекулярными массами, поэтому их широко используют для выделения и очистки биополимеров, пептидов, олиго- и полисахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток (лимфоцитов, эритроцитов), в промышленном производстве различных белковых препаратов, в частности ферментов и гормонов. 5 Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. 6
При изучении функционального состояния эндокринных желёз используются следующие методические подходы:
1. Определение исходного уровня того или иного гормона.
2. Определение уровня гормона в динамике с учётом циркадного ритма секреции.
3. Определение уровня гормона в условиях функциональной пробы.
4. Определение уровня метаболита гормона.
Таблица 1. Патогенез эндокринных заболеваний 7
Наиболее
часто в клинической практике
используется определение базального
уровня того или иного гормона. Обычно
кровь берётся натощак утром,
хотя приём пищи не отражается на продукции
многих гормонов. Для оценки деятельности
многих эндокринных желёз (щитовидной,
паращитовидных) оценки базального уровня
гормонов вполне достаточно. При определении
базального уровня гормона определённые
сложности могут возникнуть в
связи с циркуляцией в крови
нескольких молекулярных форм одного
и того же гормона. В первую очередь
это касается паратгормона.
Большинство
гормонов циркулирует в крови
в связанном состоянии с белками-переносчиками.
Как правило, уровень свободного,
биологически активного гормона
в крови в десятки или сотни
раз ниже, чем общий уровень
гормона.
Уровни
большинства гормонов имеют характерную
суточную динамики (циркадианный ритм
секреции), при этом очень часто
это динамика приобретает клиническое
значение. Наиболее важна и иллюстративна
в этом плане динамика продукции
кортизола (рис. 1.1). 8
Другими
примерами в этом плане являются
пролактин и гормон роста, ритм секреции
которых также определяется циклом
«сон-бодрствование». В основе патогенеза
ряда эндокринных заболеваний лежит
нарушение суточного ритма продукции
гормона.
Помимо
циркадианного ритма, на уровне гормона
в крови может отражаться большинство
биологических параметров. Для многих
гормонов референтные показатели в
значительной мере зависят от возраста
(рис. 1.2) 9 , пола, фазы менструального
цикла.
На уровень
ряда гормонов могут оказывать влияние
не только сопутствующие соматические
заболевания и принимаемые по поводу них
лекарственные препараты, но и такие факторы
как стресс (кортизол, адреналин), особенности
экологии (уровень тироксина в регионах
с разным потреблением йода), состав принимаемой
накануне пищи (С-пептид) и многие другие.
Основополагающим
принципом оценки деятельности гипофиз-зависимых
(щитовидная железа, кора надпочечников,
гонады) и ряда других эндокринных желёз
является определение так называемых
диагностических пар гормонов. В большинстве
случаев продукция гормона регулируется
механизмом отрицательной обратной связи.
Обратная связь может иметь место между
гормонами, принадлежащими к одной системе
(кортизол и АКТГ), или между гормонами
и его биологическим эффектором (паратгормон
и кальций). Кроме того, между гормонами,
составляющими пару, не обязательно должно
существовать прямое взаимодействие.
Иногда оно опосредовано другими гуморальными
факторами, электролитами и физиологическими
параметрами (объем почечного кровотока,
уровень калия и ангиотензин для пары
ренин-альдостерон). Изолированная оценка
показателей, составляющих пару, может
стать причиной ошибочного заключения.
Несмотря
на улучшение методов гормонального
анализа, функциональные пробы и
сегодня имеют большое диагностическое
значение в диагностике эндокринопатий.
Функциональные пробы подразделяются
на стимуляционные и супрессивные (подавляющие).
Общий принцип проведения проб заключается
в том, что стимуляционные пробы назначаются
при подозрении на недостаточность эндокринной
железы, а супрессивные – при подозрении
на её гиперфункцию.
Наряду
с оценкой уровня гормонов в крови
определённое диагностическое значение
в ряде случае случаев может иметь
определение их экскреции с мочой.
Диагностическая ценность этих исследований,
например определение экскреции
свободного кортизола, существенно меньше
таковой для современных функциональных
тестов. Аналогичным образом в настоящее
время практически полность перестали
использовать определение экскреции метаболитов
гормонов, единственным исключением является
определение уровня метаболитов катехоламинов
для диагностики феохромоцитомы.
В последние
годы широкое распространение получили
полностью автоматизированные методы
гормонального исследования, что
позволяет снизить число таких ошибок,
как неправильное взятие крови, хранение,
доставка и другие «человеческие факторы».
Из
инструментальных методов
исследования
наиболее часто используют ультразвуковое
исследование (УЗИ), рентгенографию, компьютерную
томографию (КТ), и магнитно-резонансную
томографию (МРТ). Кроме того, в эндокринологии
применяют специальные методы: ангиографию
с селективным забором крови, оттекающей
от эндокринной железы, радиоизотопное
исследование (сцинтиграфия щитовидной
железы), денситометрия костей. Основные
инструментальные методы, использующиеся
для изучения эндокринных желёз представлены
в таблице 2.
Молекулярно-генетические
методы исследования.
Бурное
развитие науки за последние несколько
десятилетий и исследования в области
молекулярной биологии, медицинской генетики,
биохимии, биофизики, тесно смыкающиеся
с микробиологией, иммунологией, онкологией,
эпидемиологией и т.д., привели к созданию
и активному внедрению в практику диагностических
лабораторий молекулярно-биологических
методов исследований генома человека,
животных, растений, бактерий и вирусов.
Эти методы чаще всего называют ДНК-исследованиями.
Методы
ДНК-исследований позволяют осуществлять
раннюю и более полную диагностику различных
заболеваний, своевременно проводить
дифференциальную диагностику и осуществлять
контроль эффективности терапии. Активное
развитие методов ДНК-диагностики и внедрение
их в практику позволяют предположить,
что недалек тот момент, когда эти методы
значительно сузят круг задач более традиционных
диагностических исследований, какими
являются методы цитогенетики, а может,
и вытеснят их из практической медицины
в научную сферу.
Таблица
2. Основные инструментальные методы
исследования
эндокринных желёз 10
В настоящее
время имеется два направления
ДНК-диагностики: гибридизационный анализ
нуклеиновых кислот и диагностика с использованием
полимеразной цепной реакции.
ПЦР сразу
же была внедрена в практику, что
позволило поднять медицинскую диагностику
на качественно новый уровень. Метод стал
настолько популярен, что сегодня уже
трудно представить работу в области молекулярной
биологии без его использования. Особенно
бурное развитие метод ПЦР получил благодаря
международной программе «Геном человека».
Были созданы современные технологии
секвенирования (расшифровки нуклеотидных
последовательностей ДНК). Если в недавнем
прошлом для расшифровки ДНК размером
в 250 пар нуклеотидов (п. н.) требовалась
неделя, то современные автоматические
секвенаторы позволяют определять до
5000 п. н. в сутки. Это, в свою очередь, способствует
значительному росту баз данных, содержащих
информацию о последовательностях нуклеотидов
в ДНК. В настоящее время предложены всевозможные
модификации ПЦР, описаны десятки различных
применений метода в том числе «лонг-ПЦР»,
позволяющая копировать сверхдлинные
последовательности ДНК. За открытие ПЦР
К. В. Mullis в 1993 году был удостоен Нобелевской
премии в области химии.
Все подходы
к генодиагностике могут быть
выделены в несколько основных групп:
1. Методы
идентификации определенных участков
ДНК.
2. Методы
определения первичной последовательности
нуклеотидов в ДНК.
3. Методы
определения содержания ДНК и
анализа клеточного цикла. 11
ПЦР позволяет
найти в исследуемом материале
небольшой участок генетической
информации, заключенный в специфической
последовательности нуклеотидов ДНК
любого организма среди огромного
количества других участков ДНК и
многократно размножить его. ПЦР
– это "in vitro" аналог биохимической
реакции синтеза ДНК в клетке.
ПЦР -
это циклический процесс, в каждом цикле
которого происходит тепловая денатурация
двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение
коротких олигонуклеотидов-праймеров
и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы
путем присоединения нуклеотидов. В результате
накапливается большое количество копии
исходной ДНК-мишени, которые легко подаются
детекции.
Результатом
открытия ПЦР стало немедленное
практическое использование метода.
В 1985 г. была опубликована статья, в
которой была описана тест-система
для диагностики серповидно- клеточной
анемии на основе ПЦР. Начиная с 1986 г. К
настоящему времени ПЦР посвящено более
10000 научных публикаций. Перспективы использования
ПЦР представляются более чем впечатляющими. 12
Цитохимические
методы исследования.
Эти методы
представляют собой варианты описанных
биологических исследований in vitro. Они
обычно обладают большей чувствительностью,
чем радиоиммунологические методы,
но значительно более громоздки
и дороги при расчете на одно определение.
Результаты цитохимических биологических
исследований количественно оценивают
на гистологических срезах с помощью
специального устройства - микроденситометра.
Гистологические срезы готовят из специфических
для данного гормона тканей или клетокмишеней,
до того подвергшихся воздействию разных
концентраций стандартного и испытуемого
гормона. С помощью денситометра сканируют
область диаметром 250 - 300 нм для количественной
оценки цветной реакции, обусловленной
изменением редокссостояния объекта под
влиянием гормональной стимуляции. Для
количественного анализа используют гистологические
красители, чувствительные к этим изменениям.
Первая
система цитохимического биологического
исследования была разработана для
АКТГ, и тканьюмишенью в этой системе
служила кора надпочечников. Другие
способы биологического определения
АКТГ либо слишком малочувствительны,
либо требуют больших объемов
плазмы. Таким образом, цитохимическое
определение редокс-состояния ткани
является ценным средством анализа
нормальной и измененной функции
системы гипоталамус-гипофиз- надпочечники
по уровню АКТГ.
Разработан цитохимический метод определения
и ЛГ, но при этом встретились существенные
трудности, связанные со значительными
колебаниями результатов разных определений
и непостоянной чувствительностью объекта,
что, возможно, отражает известные биологические
расхождения у разных животных. Чувствительные
специфические цитохимические методы
предложены для определения паратгормона,
АДГ и тиротропина.
При дальнейшем
усложнении оборудования, которое позволит
увеличить число исследований в
одном определении, этот метод может
найти более широкое применение.
Он особенно привлекателен потому,
что не требует использования
радиоактивных соединений. Цитохимические
методы нешироко применяются в клинике
и используются в основном в качестве
чувствительного способа в научных
исследованиях. 13
1.3.
Современные методы
исследования эндокринной
системы на примере
исследования щитовидной
железы
В своей
работе, ограниченной по объёму, современные
методы исследования эндокринной системы
в норме и патологии, я рассмотрю на примере
исследования эндокринной железы, что
актуально, в связи с большим распространением
заболеваний щитовидной железы в республике
Башкортостан.
1.
Ультразвуковое исследование.
УЗИ позволяет
верифицировать достаточно субъективные
данные пальпации. Оптимальными для
исследования служат датчики с частотой
7,5 Мгц и 10 Мгц. В настоящее время
используется цветное доплеровское
картирование, что позволяет визуализировать
мелкие сосуды в щитовидной железе
и дает информацию о направлении
и средней скорости потока. Возможности
метода зависят от опыта и квалификации
специалиста, проводящего исследование.
Принцип метода заключается в том, что
ультразвук, посылаемый частыми импульсами,
проникает в органы человека, отражается
на границе раздела сред с различным ультразвуковым
сопротивлением, воспринимается прибором
и воспроизводится на экране и ультрафиолетовой
бумаге. Метод безвреден и противопоказаний
не имеет (рис.1.3).
Рис.1.3.
УЗИ щитовидной железы.
Сейчас
также широко используют комплексное
ультразвуковое исследование с использованием
цветного доплеровского
картирования (ЦДК),
(рис.1.4)
. 14
Рис. 1.4.
АИТ с узлообразованием щитовидной железы
в режиме ЦДК.
2.
Тонкоигольная пункцинная
биопсия щитовидной
железы.
Тонкоигольная
пункционная биопсия ЩЖ является
единственным дооперационным методом
прямой оценки структурных изменений
и установления цитологических параметров
образований в щитовидной железе.
Эффективность получения адекватного
цитологического материала при
тонкоигольной пункционной биопсии
существенно повышается, если указанная
диагностическая процедура проводится
под контролем УЗИ, что позволяет
выявить наиболее измененные участки
щитовидной железы, а также выбрать
оптимальное направление и глубину
пункции. 15
3.
Цитологическое исследование.
Цитологическая
диагностика образований в щитовидной
железе базируется на совокупности определенных
признаков, таких как количество полученного
материала, его клеточного состава, морфологические
особенности клеток и их структурных группировок,
качество мазка и т.д.
4.
Радиоизотопное исследование (скенирование),
сцинтиграфия.
Радиоизотопное
сканирование (скенирование) - способ получения
двухмерного изображения, отражающего
распределение радио-фармпрепарата в
различных органах при помощи аппарата
- сканера.
Рис.1.6.
Результат радиоизотопного скенирования
щитовидной
железы
Скенирование позволяет определить размеры
щитовидной железы, интенсивность накопления
в ней и в отдельных ее участках радиоактивного
йода, что позволяет оценить функциональное
состояние, как всей железы, так и очаговых
образований (рис.1.6).
Сцинтиграфия
-
метод функциональной визуализации, заключающийся
во введении в организм
радиоактивных изотопов
и получении изображения
путём определения испускаемого ими
излучения
.
Пациенту вводят
радиоиндикатор
- препарат, состоящий
из молекулы-вектора и радиоактивного
маркера. Молекула-вектор поглощается
определённой структурой организма (орган,
жидкость). Радиоактивная метка служит
«передатчиком»: испускает гамма-лучи,
которые регистрируются гамма-камерой.
Количество вводимого радиофармацевтического
препарата таково, что испускаемое им
излучение легко улавливается, но при
этом он не оказывает токсического воздействия
на организм.
Для сцинтиграфии
щитовидной железы наиболее часто используется
изотоп технеция - 99m Tc-пертехнетат.
Использование 131 йода - ограничивается
выявлением функционирующих метастазов
рака щитовидной железы. Для диагностики
загрудинного и абберантного зоба, а также
в ряде случаев при ворожденном гипотиреозе
(атиреоз, дистопия, дефект органификации)
использует 123 йод. 16
5.
Определение уровня
ТТГ и тироидных
гормонов.
Исследование
уровня ТТГ и тироидных гормонов
(свободный тироксин и трийодтиронин)
показано всем с подозрением на патологию
щитовидной железы. В настоящее время
целесообразнее проводить исследование
именно свободных фракций тиреоидных
гормонов в комплексе с определением уровня
ТТГ.
6.
Определение уровня
тироглобулина в
крови.
Повышенное
содержание тиреоглобулина в крови
свойственно многим тиреоидным заболеваниям,
его выявляют и в течение 2-3 недель
после пункционной биопсии, а также
в течение 1-2 месяцев после операции на
щитовидной железе.
7.
Определение уровня
кальцитонина в
крови.
У больных,
имеющих отягощенный семейный анамнез
по медуллярному раку щитовидной железы
(синдром множественной эндокринной
неоплазии 2-го и 3-го типов), следует
в обязательном порядке определять
уровень кальцитонина в крови. Во
всех других случаях определение
кальцитонина не показано.
Нормальное содержание кальцитонина в
крови не превышает
10 пг/мл.Уровень данного маркера более
200 пг/мл, является важнейшим диагностическим
критерием медуллярного рака щитовидной
железы.
8. Испытание
функций щитовидной железы.
Тесты
функций щитовидной железы это тесты
крови, используемые для оценки, насколько
эффективно работает щитовидная железа.
Эти испытания включают проверку
стимулирующего гормона щитовидной
железы (TSH), проверку тироксина (T4), трийодтиронина
(T3), тест тироксин-связующего глобулина
(TBG), тест трийодтиронина на уровень
смол (T3RU), и долго-действующий тест
стимулятора щитовидной (LATS).
Тесты проверки функций щитовидной железы
используются для:
- помощи в
диагностировании пониженой активности
щитовидной железы (гипотиреоз), и повышенной
активности щитовидной железы (гипертиреоз)
оценки деятельности щитовидной железы
мониторинга реакции на терапию щитовидной
TSH "говорит" щитовидной железе выделять гормоны тироксин (T4) и трийодтиронин (T3). Перед использованием тестов TSH использовались стандартные анализы крови, измеряющие уровень T4 и T3 для определения того, работает ли щитовидная железа должным образом. Тест трийодтиронина (T3) измеряет количество этого гормона в крови. T3, как правило, присутствует в очень малых количествах, но оказывает значительное влияние на обмен веществ. Он является активным компонентом гормонов щитовидной железы.
Тест тироксин-связующего
глобулина (ТСГ)
проверяет уровни этого
вещества в крови, которые производятся
в печени. ГТД привязывается к T3 и T4, предотвращает
смыв гормонов из крови почками, и освобождает
их тогда и там, где они необходимы для
регулирования функций тела.
Тест трийодтиронина
на поглощение смол (T3RU)
измеряет уровни
T4 в крови. Лабораторный анализ этого теста
занимает несколько дней, и он используется
реже, чем испытания, результаты которых
доступны быстрее.
Тест стимулятора
щитовидной железы длительного
действия (LATS)
показывает, содержит ли
кровь стимулятор щитовидной железы длительного
действия. Если присутствие в крови не
в норме, LATS заставляет щитовидную производить
и выделять аномально большое количество
гормонов.
9. Компьютерная, магнитно-резонансная
томография, трансмиссионная
оптическая томография.
КТ и МРТ являются высокоинформативными неинвазивными методами, при помощи которых визуализируется щитовидная железа. Однако, данные исследования выполняются в настоящее время достаточно редко из за высокой стоимости и малодоступности соответствующей аппаратуры. Наряду с оценкой локализации щитовидной железы, ее контуров, формы, размеров, структуры, соотношения с прилежащими тканями, размеров и структуры регионарных лимфоузлов, КТ позволяет определить денситометрическую плотность образований в щитовидной железе. Как КТ так и МРТ являются методами выбора в диагностике загрудинного зоба. Компьютерная томография (КТ) - метод рентгеновского исследования, основанный на неодинаковой поглощаемости рентгенологического излучения различными тканями организма, в основном используется в диагностике патологии щитовидной железы, брюшной области (печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, почки, надпочечники и др.)
Компьютерная томография позволяет получить сведения о конфигурации размерах, расположении и распространенности любого образования, поскольку этот метод дифференцирует по плотности твердые и мягкие ткани.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) - инструментальный метод диагностики, с помощью которого в эндокринологии проводится оценка состояния гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой системы, скелета, органов брюшной полости и малого таза.
МРТ позволяет получить сведения о конфигурации костей, размерах, расположении и распространенности любого образования, поскольку этот метод дифференцирует по плотности твердые и мягкие ткани.
МРТ, в последние годы, приобретает все большее значение в диагностике патологии гипоталамо- гипофизарной области и становится методом выбора при обследовании больных с подозрением на наличие поражения именно этой области (рис.1.7).
Рис.1.7. Подготовка к МРТ.
В процессе магнитно-резонансной томографии подвижный стол с пациентом двигается через "туннель", генерирующий электромагнитное поле, которое в свою очередь создает излучение, позволяющее получить трехмерное изображение внутренней структуры организма.
Диагностируемые при помощи МРТ заболевания:
- ? опухоли
гипофиза (например,
пролактинома
, болезнь Иценко-Кушинга)
- ? образования
надпочечников (например, синдром Иценко-Кушинга,
альдостерома, феохромоцитома)
- ? остеопороз
- ? и
др.
- ? позволяет
получить срезы толщиной 2-3 мм в любой
плоскости
- ? возможность
по характеру сигнала судить не только
о наличии образования, но и о
его внутренней структуре (кровоизлияния,
кисты и т.д.)
- ? отсутствие
воздействия на пациента ионизирующей
радиации и практически полная безвредность,
что имеет значение при обследовании
детей, а также, при необходимости,
многократных повторных исследований.
Рис. 1.8. Система
CTLM - один из первых в мире серийных оптических
томографов.
10.
Иммунногистохимическое
исследование ткани
опухолей щитовидной
железы.
Проводятся
в ткани опухолей щитовидной железы,
получаемой в результате операции.
Основная цель данного исследования
- прогностическая. В ткани щитовидной
железы определяют наличие таких
веществ как р53 (генсупрессор роста
опухоли), CD44, Met (протеогликаны, ответственные
за метастазирование), РТС, ras-онкогенов
(онкогены, регулирующие опухолевую прогрессию)
и других. Наиболее важным в клинической
практике является выявление иммуннореактивности
р53, Met
и РТС в ткани раков щитовидной
железы. Наличие данных маркеров в ткани
опухоли - это признак быстрого (в течение
2-5 месяцев) развития метастатической
болезни у прооперированного пациента.
Исследование является дорогостоящим
и требует специального лабораторного
оборудования. В настоящее время определение
опухолевых маркеров в основном проводят
в специализированных онкологических
клиниках по определенным показаниям,
а именно - при наличии у больного других
прогностических признаков рецидива опухоли
или развития метастатической болезни
(низкодифференцированный рак щитовидной
железы, возраст больного старше 55 лет,
инвазия окружающих тканей опухолью и
др.). 18
11.
Иммунологические
методы.
К иммунологическим
методам в первую очередь относят иммуноферментный
анализ (ИФА). ИФА - метод выявления антигенов
или антител, основанный на определении
комплекса антиген-антитело за счет:
- предварительной
фиксации антигена или антитела на подложке;
добавления исследуемого образца и связывание фиксированных антигена или антитела с антигеном-мишенью или антителом-мишенью;
последующего добавления антигена или антитела, меченного ферментативной меткой с ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску под действием фермента. Изменение цвета реакционной смеси свидетельствует о присутствии в образце молекулы-мишени.Определение продуктов ферментативных реакций при исследовании тестируемых образцов проводят в сравнении с контрольными пробами.
Исследование уровней антитиреоидных антител – иммунохемилюминесцентный метод . Исследована распространенность антител к антигенам ткани щитовидной железы: тиреоглобулину, тиреоидной пероксидазе и рецептору ТТГ у пациентов с диффузным токсическим зобом и эндокринной офтальмопатией. При обследовании у таких пациентов отмечается высокий уровень антител к рецептору ТТГ, который снижается на фоне тиреостатической терапии. 20 Показано, что определение антител к рецептору ТТГ и тиреоглобулину должно служить дополнительным диагностическим критерием при обследовании. 21
Методы определения антител к рецептору ТТГ:
1. Определение TBII
1.1. Радиорецепторный метод
1.1.1. С использованием свиного рТТГ (TRAK)
1.1.2. C использованием человеческого рТТГ, экспрессированного СНО-клетками (СНО-R)
1.1.3. С использованием рТТГ, экспрессированного лейкемическими летками (K562)
1.2. FACS
1.3. Иммунопреципитация
2. Биологические методы определения стимулирующих (TSAb) и блокирующих (TBAb) антител
2.1. Оценка продукции цАМФ (определяется с помощью РИА)
2.1.1. в FRTL-5 клетках
и т.д.................
Функциональная активность эндокринных желез, выражающаяся в интенсивности процессов биосинтеза и секреции гормонов, может варьироваться в широких пределах при различных состояниях данного организма. Она находится в зависимости от возраста, пола, времени дня, сезона, внешних и внутренних воздействий на организм, передающихся к железам через специальные системы регуляции.
Активность каждой железы может значительно отличаться у разных видов животных. Оценка функционального состояния эндокринных желез — одна из важнейших задач теоретической и практической эндокринологии, в частности клинической.
Существует ряд прямых и непрямых подходов к оценке секреторной активности эндокринных органов. Наибольший интерес среди них представляют исследования работы желез in vivo в хроническом опыте, в условиях, максимально приближающихся к физиологическим. Показано, что количественное изучение процессов биосинтеза и секреции в опытах in vitro приводит обычно к искусственному занижению их уровней (падение до 10%) по сравнению с данными, полученными in vivo в условиях нормального кровоснабжения и иннервации железы, нормального гормонального баланса и т.д. (Дорфман, Унгар, 1965).
В связи с этим количественная оценка физиологических уровней продукции гормонов в прямых экспериментах in vitro малопригодна. Также ограниченное физиологическое значение имеют методы прямого измерения секреции гормонов в кровь, оттекающую от эндокринных желез в условиях острого опыта. Действительно, такие исследования проводятся в условиях обездвиживания и наркотизации животного, сильных хирургических вмешательств (вскрытие полостей тела, канюлирование сосудов и т.д.). Все это резко искажает нормальное течение процессов биосинтеза и секреции гормонов.
Бесспорно, заслуживают внимания методы хронического вживления ангиостомических трубок (канюль) в участки кровеносного русла, которые отводят кровь от исследуемых желез (Нелсон, Хьюм, 1955; В.М. Родионов и др.; 1960). Однако такого рода экспериментальные подходы практически осуществимы далеко не для всех желез, не у всех видов животных и не могут быть использованы применительно к здоровому человеку.
Один из наиболее распространенных способов количественной оценки секреторной активности эндокринных желез у человека и животных in vivo — определение концентрации гормонов в периферической крови. Этот способ оценки непрямой, так как отражает не только работу желез, но и степень связывания гормонов с белками крови, интенсивность гормонального метаболизма и экскреции. Если функции печени и почек существенно не изменены и уровень плазменных белков, связывающих определяемые гормоны, постоянен, концентрация гормонов в периферической крови может прямо коррелировать с секреторной активностью соответствующих желез.
Наряду с определением концентрации гормонов в крови в состоянии покоя может иметь существенное значение измерение функциональных резервов железы, проводимое с применением функциональных проб. Так, для изучения функциональных резервов коры надпочечников проводят пробу с введением АКТГ, инсулярного аппарата — с введением глюкозы и т.п. Среди методов определения содержания гормонов в крови (биологических, фотометрических, флюорометрических, радиоизотопных) наибольшее внимание исследователей привлекают методы сатурационного, или конкурентного, белковосвязывающего анализа.
В основе этих методов лежит вытеснение определяемым эндогенным гормоном меченного тритием (3Н) или радиоактивным йодом (1251) того же гормона из комплекса со специфически связывающим его белком (иммунным, транспортным или рецепторным). Тестирующей системой анализа являются белок и специфически связываемый им меченый гормон. Чем больше эндогенного гормона содержится в исследуемой пробе плазмы, тем большее количество метки он вытесняет из комплекса с белком.
Методы сатурационного анализа и особенно радиоиммунологические методы (Берсон, Ялоу, 1960, 1961), в которых применяются в качестве связывающих белков антитела к гормону, обладают высокими специфичностью и чувствительностью. Этим они значительно превосходят все другие методы исследования концентрации гормонов, позволяя высокоспецифически определять малые их количества (10-12—10-9 г) и за счет этого использовать для анализа всего 10-3—10-1 мл плазмы крови. Последнее обстоятельство очень важно, поскольку гормоны содержатся в крови в очень низких концентрациях.
Получил распространение иммуноферментный метод, в котором в качестве маркера используется гормон, ковалентно связанный с ферментом (щелочной фосфатазой, пероксидазой), дающим легко воспроизводимую высокочувствительную цветную реакцию с соответствующим субстратом. Иммуноферментные методы, мало уступая радиоиммунологическим по чувствительности, устраняют некоторую радиационную опасность и необходимость использования сложной дорогостоящей аппаратуры для счета радиоактивности (Шуурс. 1972; Отзуки и др., 1979).
В табл. 3-9 обобщены данные, полученные с помощью радиологических, иммуноферментных, флюорометрических методов, по массовым концентрациям ряда гормонов в крови человека и некоторых видов животных при различных физиологических или патологических состояниях организма.
Таблица 3. Концентрация кортизола (F) и кортикостерона (В) в плазме крови человека и некоторых видов животных (мкг %)
Таблица 4. Концентрация прогестерона в плазме крови человека и некоторых видов животных (мкг%)
Таблица 5. Концентрация эстрадиола (Е2) и эстрона (E1) в плазме крови здорового человека (нг%)
Таблица 6. Концентрация 1,25-диоксихолекальциферола в плазме крови человека и животных разных видов
Таблица 7. Концентрация катехоламинов в крови человека при разных состояниях организма (нг%)
Таблица 8. Концентрация трийодтиронина (Т3) тетрайодтиронина (Т4) в крови здорового человека и животных разных видов
С помощью радиоиммунологического метода установлено, что концентрация альдостерона в плазме крови здорового человека при обычной диете составляет 7-14 нг%, при солевой нагрузке — 1-2,5, при бессолевой диете — 15-35 нг%. Этим же методом показано, что в плазме крови здорового половозрелого мужчины концентрация Т составляет 550-800 нг%, DT — 20-40, Д4 — 90-175, ДЭА — 350-850 нг%, в плазме крови здоровой половозрелой женщины — соответственно 40-70, 10-20, 130-200, 450-600 нг%.
Таблица 9. Концентрация некоторых белково-пептидных гормонов в плазме крови здорового человека при различных состояниях организма (нг%)
Другой достаточно адекватный, хотя также непрямой способ количественной оценки секреторной активности эндокринных желез, — измерение суточной экскреции с мочой гормонов или их специфических метаболитов. В случае нормальной работы печени и почек величины экскреции гормональных соединений могут пропорционально отражать интенсивность секреторных процессов в соответствующих железах.
Для определения гормонов и их метаболитов в пробах мочи в эксперименте и клинике широко используют методы сатурационного анализа и др. Поскольку многие гормональные метаболиты экскретируются с мочой в больших количествах (до нескольких мг за сутки), то они в ряде случаев могут быть легко определены колориметрически и флюорометрически.
Определение гормональных соединений в моче может быть затруднено, если они экскретируются преимущественно не с мочой, а с желчью (например, у крысы или мыши).
Несмотря на то, что измерения концентрации гормонов в крови и суточной экскреции гормональных соединений с мочой в покое или при функциональных нагрузках могут довольно надежно характеризовать интенсивность продукции гормонов эндокринными железами, получаемые с их помощью характеристики не дают представления об истинных величинах скоростей этих процессов.
Истинные величины скоростей продукции гормонов in vivo в условиях хронического исследования могут быть получены без хирургического вмешательства с помощью метода разведения изотопной метки (Пирлмэн, 1957). Данный метод также непрямой. Он основан на введении в исследуемый организм следовых количеств соответствующего меченого гормона с высокой удельной радиоактивностью и последующим измерением скорости разведения метки экзогенного гормона эндогенным, продуцируемым. Скорость разведения метки определяется по кинетике снижения удельной радиоактивности гормона или его специфического метаболита, выявляемых в крови или моче. Простая математическая обработка данных по измерению кинетики разведения позволяет подсчитать скорость продукции исследуемого гормона в организме.
Технически более прост и удобен вариант метода с исследованием разведения метки в гормональных соединениях мочи.
Принцип данного варианта метода основывается на том. что степень разведения метки в крови эндогенным, секретируемым гормоном равна степени разведения меченого гормона или его специфического метаболита в суточной моче немеченным, эндогенным. На основе этого принципа, обозначив радиоактивность вводимого гормона R. радиоактивность исследуемого гормонального соединения в суточной моче г. его количество М, а количество гормона, поступающего в кровь за сутки Р.
Получаем: R/P - r/M. Очевидно, Р — сумма количества эндогенного, секретируемого за сутки гормона (Рх) и количества экзогенного, меченого (Pr), т.е. Р=Рх + Pr. Тогда, зная величины А и Pr и экспериментально определив величины г и М, рассчитываем Р=RM/r, а Рх=Р — Pr. Рдг и есть скорость продукции гормона. Поскольку удельная радиоактивность гормонального соединения мочи a = r/M, R/Р = а или Р = R/a
Так как меченый гормон вводится в таких экспериментах в следовых количествах, чтобы не изменить эндогенный гормональный баланс, и обычно Рх » Ря, расчетом Рх=Р — Pr можно практически пренебречь. Следует отметить, что равенство R/P = a действительно, если есть динамическое равновесие между скоростью продукции гормона, с одной стороны, и его метаболизмом — с другой, и если скорость выведения гормонального соединения почками относительно постоянна, а функция самих почек нормальна.
Определение величины скорости секреции гормона по разведению вводимой изотопной метки в крови с технической стороны значительно более сложно, так как требует многократного взятия крови и определения в ней удельной радиоактивности исследуемого гормона в течение одного опыта.
Для определения скорости продукции гормона в этом варианте метода пользуются уравнением Р = Q/T. где Р — скорость продукции, Q — общее количество гормона в циркулирующей крови, Т — время оборота, т.е. полного обновления меченого гормона в крови за счет секреции эндогенного гормона. Это уравнение справедливо лишь при наличии динамического равновесия между процессами непрерывной продукции гормона, его метаболизма и выведения его из крови. Поскольку Q = СУ, где С — концентрация гормона, а V — объем крови, то Р = СV/Т. Величины С и К легко определить. Наибольшую техническую трудность представляет нахождение величины Т. Ее находят графически путем экстраполяции полулогарифмических кривых разведения меченого гормона (снижения его удельной радиоактивности) во времени.
Практически наиболее точно определяется из получающихся линейных графиков не сама величина Т, a Т1/2. т.е. время полузамещения метки введенного гормона эндогенным, немеченым.
Данные по скорости продукции гормонов, получаемые с помощью вариантов метода разведения изотопной метки с использованием крови и мочи, обычно хорошо совпадают. Необходимо иметь в виду, что полученные этим методом результаты могут отражать не только скорость секреции гормонов соответствующими железами, но и скорость образования гормонов в периферических тканях, если оно имеет место, как, например, в случае тестостерона или трийодтиронина.
Скорости секреции гормонов железой и продукции их на периферии могут быть отдифференцированы друг от друга. Однако эта процедура технически сложна и редко используется в экспериментальной и клинической практике.
С помощью вариантов метода разведения изотопной метки установлено, что различные гормоны продуцируются со скоростью от нескольких микрограммов до десятков миллиграммов за сутки, причем величина скорости продукции каждого гормона может широко варьироваться в зависимости от физиологических условий. Наиболее полно изучена скорость продукции стероидных гормонов у человека (табл. 10).
Таблица 10. Скорость продукции стероидных гормонов у человека при различных патологических состояниях организма (обобщенные данные)
В.Б. Розен