- Bordetella pertussis - был выделен из мокроты ребенка, больного коклюшем, в 1906 г. Борде и Жангу. В 1937 г. был описан микроб от больного коклюшем, сходный, но не идентичный с бактерией пертуссис (коклюша), названный бактерией парапертуссис (паракоклюша). Морфология: короткая грамотрицательная овоидной формы палочка размером 0,2 на 0,4-1,2 мкм. При окраске толуидиновым синим обнаруживаются биполярно расположенные метахрома-тические гранулы. У палочки коклюша можно обнаружить также капсулу.
Биология палочки, культуральные свойства:
свежевыделенные культуры коклюшных микробов, S-форма, или 1 фаза по Лесли и Гарднеру, растут только на питательной среде, состоящей из картофельно-глицеринового агара с добавлением крови {среда Барде-Жангу).
Колонии палочки коклюша
гладкие, блестящие, прозрачные, куполообразные с жемчужным или ртутным оттенком, размером около 1 мм в диаметре. Колонки бактерии паракоклюша по внешнему виду очень похожи на бактерии коклюша, но они более крупные по размерам и появляются раньше, чем коклюшные колонии.
Бактерии коклюша, так же как атипичные и паракоклюшные, растут на обычных питательных средах. На полусинтетической среде - казеиново-угольном агаре (КУА) - колонии коклюшных микробов мелкие (0,5-1 мм), выпуклые, четко контуриро-ванные, блестящие, гладкие, серовато-кремового цвета и вязкой консистенции.
Колонии коклюшных и паракоклюшных микробов на среде Борде-Жангу окружены характерной зоной гемолиза (зона нерезко отграничена и распространяется диффузно в окружающую среду). Коклюшные микробы не редуцируют сахара, не образуют индола, не редуцируют нитратов и не используют цитратов. Коклюшный микроб — факультативный аэроб. Оптимальные условия культивирования 35-36 °С.
Дифференциальными признаками
бактерии пертуссис и бактерии парапертуссис служат данные серологических исследований (реакция агглютинации и биохимическая характеристика). Основные отличительные признаки, позволяющие дифференцировать коклюшные и паракоклюшные культуры: паракок-люшные растут при первых пересевах на простом агаре (без крови), на казеиново-угольном агаре и мясо-пептонном агаре (особенно с добавлением тирозина), а также на кусочке картофеля, образуя коричневый пигмент, расщепляют мочевину, утилизируют цитраты.
Коклюшный микроб на простом агаре не растет, пигмента не образует и мочевину не расщепляет. Кроме того, антительной сывороткой коклюшные и паракоклюшные возбудители агглютинируются примерно до Vio титра. Также ставят пробу на уреазу - в пробирку с исследуемой культурой добавляют мочевину и фенолфталеин, пробирку встряхивают и ставят в термостат. Реакция (изменение цвета) может наступить через 15- 20 мин. Окончательный результат учитывается через 2 ч. Положительная реакция - окрашивание жидкости в малиновый цвет - свойственна культурам паракоклюшных бактерий.
Устойчивость к физическим и химическим факторам.
Антигенное строение
Коклюшный микроб по антигенным свойствам однотипен, но отличается сложностью антигенного строения - у него удается выявить до 12 антигенных компонентов. Коклюшный микроб имеет собственные видовые антигены и общие с паракоклюшными. Общие антигены имеются как у обоих видов (О-антиген), так и отдельно с каждым из них. Из коклюшных микробов были выделены фракции, обладающие иммунологическими свойствами: агглютиноген, ге-магглютинин и протективный антиген.
Патогенность, вирулентность, образование токсина. В естественных условиях к коклюшу восприимчив только человек. Наиболее близкая по симптоматике к коклюшу картина заболевания была экспериментально воспроизведена у обезьян. Куриные эмбрионы, крысы и морские свинки при введении культуры погибают от интоксикации. Внутрикожное введение культуры коклюшных микробов экспериментальным животным вызывают образование некроза в результате освобождения при разрушении микробных клеток ее токсичных компонентов.
Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae).
Дифтерия (diphtheria) - острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией организма и образованием пленчатых налетов в месте внедрения возбудителя. Возбудитель дифтерии - Corynebacterium diphtheriae. Этот род не включен ни в какое семейство, содержит патогенные и непатогенные виды.
Морфология . Тонкие, прямые или слегка изогнутые полочки, на одном или обоих концах клетки есть утолщение, что придает им вид булавы. Микроорганизмы весьма полиморфны, могут встречаться нитевидные, ветвящиеся образования, иногда приобретают вид кокков или дрожжевых грибов. Неподвижны, не образуют спор и капсул. Грам-положительные. В мазках располагаются под углом друг к другу в виде буквы “V”, иногда больше двух - тогда их сравнивают с растопыренными пальцами руки. В цитоплазме имеются включения - гранулы волютина (у Corynebacterium diphtheriae их не более шести, у некоторых непатогенных видов количество гранул достигает 18-20). Волютин обладает способностью необычно воспринимать окраску. При окраске метиленовой синью волютин окрашивается в синий, черный или даже красный цвет - метахроматический эффект, поэтому волютин называют метахроматином. Волютин представляет собой неорганические полифосфаты (запас энергии).
Коринебактерии относятся к факультативным анаэробам, лучше растут в аэробных условиях. Плохо растут на обычных питательных средах, лучше на средах с добавлением крови, сыворотки крови любого вида животных, с добавлением теллурита калия (среда Клауберга), подавляющего рост сопутствующей микрофлоры. На средах с теллуритом колонии коринебактерий темно-серые или черные, это объясняется тем, что коринебактерии восстанавливают теллурит до металлического теллура.
По культуральным свойствам коринебактерии делятся на три биовара:
1. gravis (грубый) - на кровяном теллуритовом агаре - радиально исчерченные колонии серовато-черного цвета с уплощенным центром, диаметр 2-3 мм, на жидких средах - в виде пленки и зернистого осадка, не обладают гемолитической активностью.
2. mitis (тонкий) - на кровяном теллуритовом агаре - выпуклые черные гладкие колонии с ровными краями, мелкие - диаметр 1-2 мм, на бульоне - помутнение и осадок, вызывают гемолиз.
3. intermedius (промежуточный) - сочетает признаки gravis и mitis, по основным признакам ближе к mitis, на бульоне - в виде зернистого осадка, не обладают гемолитической активностью.
Коринебактерии ферментируют глюкозу, мальтозу, галактозу до кислоты, не сбраживают лактозу, сахарозу, маннит. Обладают каталазной активностью, восстанавливают нитраты в нитриты, расщепляют цистин с образованием H 2 S. Не расщепляют мочевину (не обладают уреазной активностью). Вариант gravis сбраживает кроме этого крахмал и гликоген.
Все три биовара продуцируют одинаковый экзотоксин. Летальная доза дифтерийного экзотоксина для человека 0.5 мг/кг массы тела. Экзотоксин имеет белковую природу, получен в кристаллическом виде. Образованию экзотоксина способствует низкая концентрация Fe в среде, это объясняется тем, что у коринебактерий образуется белок-репрессор гена, кодирующего синтез экзотоксина. Этот белок является Fe-содержащим, чем больше он насыщается Fe, тем выше его репрессорная активность. Экзотоксин термолабилен (56-60°C - 1 час, 80°C - несколько минут), инактивируется прямым солнечным светом, ультрафиолетовым облучением, O 2 . При добавлении слабого раствора формалина (0.3-0.4%, 1 месяц, 38-40°C) превращается в анатоксин (токсоид). Дифтерийный токсин разрушается протеолитическими ферментами ЖКТ. Образуется как в организме, так и на питательных средах. Состоит из двух фрагментов - A и B. Фрагмент B (39000 Да) обеспечивает адсорбцию молекулы токсина на клеточной мембране и последующее проникновение токсина в клетку. Фрагмент A (24000 Да) инактивирует фактор элонгации полипептидной цепи (трансфераза II) и тем самым нарушает синтез белка в клетке. В 1951 г. была установлена возможность перехода нетоксигенных штаммов в токсигенные вследствие заражения умеренным фагом β-tox+ (фаговая (лизогенная) конверсия). Это может происходить in vitro и in vivo. Таким образом экзотоксин продуцируется лизогенным штаммом.
Коринебактерии образуют дермонекротический фактор, продуцируют ферменты агрессии (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин), гемотоксин, лейкоцидин.
Антигены. Коринебактерии содержат K-антиген (термолабильный, обладает типовой специфичностью), содержат соматический O-антиген (термостабильный, обладает родовой специфичностью). На основе O-антигена выделяют 11 сероваров (7 основных и 4 дополнительных, редко встречающихся).
Резистентность . В окружающей среде довольно устойчивы, хорошо сохраняются при низкой температуре, при высушивании, в пыли - в течении 5 недель, в воде и молоке - до 20 дней, в тканях трупа - в течении 2 недель. При воздействии высокой температуры довольно быстро погибают, но если они находятся в сухой пленке, то выдерживают нагревание до 98°C.
Устойчивы к обычно использующимся дезинфектирующим веществам. Уступают по устойчивости только спорообразующим микроорганизмам.
Чувствительны к пенициллину, умеренно резистентны к сульфаниламидным препаратам.
Патогенез и клиника. В естественных условиях болеет только человек. К действию дифтерийного токсина чувствительны также кролики и морские свинки.
Входные ворота - слизистые оболочки верхних дыхательных путей (миндалины, зев, носоглотка, гортань, трахея), реже - конъюнктива глаз, кожа наружного слухового прохода, слизистая оболочка гениталий девочек, раневая поверхность (чаще в странах с тропическим климатом).
Возбудители остаются в месте внедрения, размножаются, вырабатывают экзотоксин, который оказывает как местное, так и общее действие. Местное - возникновение воспалительных реакций, формирование пленчатых налетов (diphthera), характер которых определяется локализацией ворот (на слизистой, покрытой однослойным эпителием - крупозная пленка, рыхло связанная с подлежащей тканью; на слизистой, покрытой многослойным эпителием - дифтерическая пленка, плотно спаянная с подлежащей тканью, с трудом снимается, если снять - образуется кровоточащая поверхность). Пленчатые налеты - конгломераты нитей фибрина, некротизированных клеток эпителия, эритроцитов, лейкоцитов и самих бактерий. В легких случаях пленки могут отсутствовать, местные изменения ограничены воспалением.
Обычно наблюдается увеличение регионарных лимфатических узлов, у некоторых больных может развиться массивный отёк шеи (ложный круп), если входные ворота - верхние дыхательные пути. Экзотоксин всасывается в кровь → токсинемия → поражение всех органов и тканей. Наиболее чувствительны сердечная мышца, нервная ткань и ткань надпочечников. В этих органах - дегенеративные изменения клеток, может наблюдаться жировая инфильтрация, затем очаги некроза. Могут наблюдаться обширные кровоизлияния.
Инкубационный период 2-10 дней (в среднем 5-7 дней). В зависимости от локализации входных ворот различают клинические формы. Самая частая - дифтерия зева, вовлекаются в процесс полость носа или гортань (самая тяжелая форма дифтерии - дифтерийный (истинный) круп - поражение гортани → отслаивание дифтерических пленок → обтурация гортани, ларингоспазм → асфиксия - лечение наложением трахеостомы ниже места обтурации). Также может быть дифтерия глаза, уха, половых органов, ран. Во всех случаях патогенез один и тот же.
Есть корреляция между биоваром и тяжестью болезни. Раньше самую тяжелую форму вызывал mitis, сейчас - gravis (в 90 гг.).
Иммунитет антитоксический и антибактериальный. Основная защитная роль у антитоксического иммунитета. После перенесения дифтерии - прочный, продолжительный, но не абсолютный (5-6% повторные заболевания) иммунитет.
Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Материал исследования - пленка, фрагмент на границе со здоровой тканью. Если клетки там отсутствуют, берут отделяемое слизистых. Материал берут сухим тампоном или увлажненным (перед стерилизацией) 5% глицерином.
I этап - ● Посев на элективные среды (кровяной теллуритовый агар - среда Клауберга).
● Одновременно - посев на среды накопления (они же являются транспортными средами) - 5% глицерин, pH = 7.2.
II этап - накопление чистой культуры (среда Ру со свернувшейся лошадиной сывороткой).
III этап - ● У выделенной культуры определение токсигенности методом Оухтерлони - реакция преципитации в сывороточном агаре (помещают на среду полоску, смоченную антитоксином, по одну сторону сеют исследуемый штамм, по другую - музейные штаммы (заведомо токсигенные и нетоксигенные)).
● Серологические методы (РГА, РНГА) имеют вспомогательное значение - диагноз лишь ретроспективно, можно применять для оценки уровня напряженности антитоксического иммунитета (титр 1:80 и выше - невосприимчивые люди, если в меньшем разведении или нет - нужна ревакцинация), а также для планирования прививочных мероприятий (оценка напряженности антитоксического иммунитета у населения).
● Определение биохимической активности - проба Закса (на уреазу) и проба Пизу (на цистиназу).
На всех этапах - микроскопия. Но при микроскопировании нативного материала, нельзя определить токсигенность и дифференцировать от непатогенных дифтероидов.
Ускоренная диагностика - бактериоскопическая (эффективность невелика), люминесцентно-серологический (не позволяет определить токсигенность).
Для оценки напряженности антитоксического иммунитета на протяжении многих лет использовалась кожная проба Шика (1/40 DLM токсина), если иммунитет напряженный, никаких изменений в месте введения не будет, если мало напряженный, будет воспалительная реакция (покраснение, припухлость). Это не аллергическая проба. Сейчас проба Шика практически не используется, применяется РНГА (см. выше).
Эпидемиология . Источник инфекции - больной человек, носитель. Больные заразны на протяжении всей болезни и в период выздоровления. Особенное эпидемиологическое значение имеют больные со стертыми формами, важную роль играют носители. Носительство (2-3 недели, редко до месяца) обнаруживалось в некоторые периоды у 10% людей. Пути передачи: воздушно-капельный, воздушно-пылевой, предметно-бытовой, алиментарный (молоко и молочные продукты). Подъем заболеваемости в холодное время года. До начала массовой вакцинации были наиболее уязвимы дети первых 5 лет, после - сдвиг на более старшие возрастные группы, нередко болеют взрослые (у них чаще стертая форма, клиническая картина ангины). В настоящее время среди детей подъем заболеваемости в 100 раз, среди взрослых - в 260 раз, но все равно меньше чем до массовой вакцинации.
Лечение и профилактика. Лечение антитоксической противодифтерийной лошадиной сывороткой как можно раньше. Антибиотики (пенициллин). С целью специфической профилактики - анатоксин (в составе АКДС, АДС, АД), иммунизация проводится в 6 месяцев, в 3 года, в 7 и 17 лет.
Возбудитель коклюша (Bordetella pertussis).
Коклюш (pertussis) - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, основной симптом которого - приступы судорожного кашля. Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis - был выделен в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу.
Морфология . Короткие грам-отрицательные палочки овоидной формы. При окраске наблюдается биполярность (концы окрашиваются более интенсивно вследствие неравномерного распределения липидов в клетке). Неподвижны, не образуют спор. При окраске по Романовскому-Гимзе видна капсула. Облигатные анаэробы. Оптимум температуры 35-37°C. Очень требовательны к питательным средам. В процессе роста выделяют много жирных кислот, которые препятствуют росту самих бактерий. Для нейтрализации их к среде примешивают ионообменные смолы, кровь, древесный уголь. Используют комбинированный казеиново-угольный агар - КУА. Кровь содержит также факторы роста (необязательные для микроорганизмов, но в их присутствии колонии растут лучше). При культивировании на плотных средах неоднородны, выделяют 4 фазы:
1) гладкие колонии (S-форма), микроорганизмы образуют капсулу;
4) R-форма - не образуют капсулу, теряют вирулентность;
2-3) переходные;
Вирулентна только первая фаза колоний.
Колонии мелкие (диаметр < 1 мм), вязкой консистенции, формируются на 3-4 день после посева. На жидких средах - равномерное помутнение и осадок. Биохимическая активность - инертны, вызывают гемолиз эритроцитов.
Антигенная структура очень сложная. Диагностическое значение имеют только агглютиногены. Делятся на несколько сероваров. Содержат эндотоксин, вырабатывают экзотоксин, частично связанный с бактериальной клеткой → может освобождаться только после разрушения клеток, имеет белковую природу. При введении мышам токсин вызывает некроз, геморрагии и дегенерацию клеток почек, селезенки и печени.
Кроме того микроорганизм продуцирует гистаминсенсибилизирующий фактор и лимфоцитозстимулирующий фактор. К факторам вирулентности относится и капсула.
В естественных условиях болеет только человек. В эксперименте удалось воспроизвести заболевание у обезьян.
Патогенез и клиника. Входные ворота - слизистые оболочки гортани, трахеи и бронхов. Микроорганизмы локализуются на поверхности клеток, размножаются, часть погибает, освобождая эндо- и экзотоксин. Это приводит к возникновению воспалительной реакции эпителия, затем появляются очаги некроза. Все это вызывает постоянное раздражение окончаний афферентных волокон nervus vagus → импульсы в кашлевой центр → стационарный очаг возбуждения (по типу доминанты) → приступы судорожного кашля. Из области кашлевого центра возбуждение иррадиирует на соседние участки → рвота, спазм, снижение артериального давления. Нарушается легочная вентиляция, увеличивается проницаемость сосудов → гипоксемия и ацидоз. Формируется реакция ГЧЗТ (сильный бактериальный аллерген). Для заболевания характерна цикличность:
1. инкубационный период (5-21 день);
2. катаральный период - субфибрильная температура, может быть насморк, слабо выраженный кашель, постепенно усиливающийся, к концу 2 недели - приступообразный характер;
3. конвульсивный (судорожный) период - появление приступов кашля при действии любых раздражителей (специфических и неспецифических). Во время приступа кашля толчки быстро следуют друг за друга на фоне затрудненного вдоха → характерный свистящий звук - кашель с репризами. Приступ заканчивается отделением густой вязкой мокроты (или рвотой) - до 40-50 раз в сутки. Во время приступа - цианоз лица и тела. На высоте приступа может быть асфиксия, имеются данные о случаях разрыва ребер.
Осложнения:
а) бронхопневмония,
б) ателектазы (полное спадение бронхов) → нарушение вентиляции → размножение анаэробной микрофлоры → гангрена легкого,
в) клапанная обтурация → эмфизема → бронхоэктатическая болезнь (размножение гноеродных кокков (Staphylococcus, Streptococcus)).
Температура в течении всего периода - нормальная. Продолжительность конвульсивного периода - 4-6 недель.
4. период угасания (разрешения) - 2-3 недели, число приступов сокращается.
Может быть стертое течение (в основном у привитых) - отсутствуют приступы кашля, представляет эпидемиологическую опасность. После перенесения заболевания - прочный. пожизненный иммунитет.
Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Способ взятия материала:
1) мазок с задней стенки глотки стерильным тампоном (возникает кашель → капли попадают на тампон).
2) “кашлевые пластинки” - подносится чашка с питательной средой (Клауберга) к лицу и капли при кашле засеиваются на неё (в основном для детей).
3) у взрослых материал можно брать с помощью бронхоскопии.
Серологические методы - РСК, РНГА - второстепенное значение.
Эпидемиология . Источник - больной (наиболее опасен - в катаральный период). Часто носительство у взрослых. Коклюш - одна из самых высоко заразных инфекций. Из-за малой устойчивости возбудителя единственный путь передачи - воздушно-капельный. Сезон подъема заболеваемости - холодное время года.
Специфическая профилактика : используются убитые вакцины (АКДС), коклюшный компонент - самый нестабильный, самый реактогенный, у привитых могут возникать аллергические реакции (вплоть до анафилаксии).
В 1937 году был открыт возбудитель паракоклюша - Bordetella parapertussis. Морфологически сходна, растет быстрее на тех же средах (1-2 сутки), колонии больше, имеют общие формы антигенов, но перекрестного иммунитета нет. Образует уреазу. Клинически вызывает легкую форму коклюша. Лабораторная диагностика такая же. Специфической профилактики не проводится, встречается реже.
Возбудитель коклюша представляет собой небольшие коккобактерии, располагающиеся поодиночке или попарно. Неподвижны, спор не образуют, имеют капсулу, пили. Грамотрицательны. Хемоорганотрофы, метаболизм только окислительный, строгие аэробы. Возбудитель коклюша не растет на простых питательных средах. В качестве факторов роста необходимы некоторые аминокислоты. Рост на простых питательных средах ингибируется образующимися жирными кислотами. Для их нейтрализации применяют кровь, древесный уголь или ионообменные смолы. Возбудитель культивируется на картофельно-глицериновом агаре с добавлением крови (среда Борде-Жангу), на кровяном агаре и на полусинтетическом казеиново-угольном агаре без добавления крови. Колонии коклюшных бактерий мелкие, круглые, с ровными краями, блестящие, напоминающие капельки ртути или зерна жемчуга. Свежевыделенные культуры образуют S-форму колоний (1 фаза), при дальнейшем культивировании могут образовывать R-формы (2 фаза). На кровяных средах образуют зону гемолиза. В.pertussis ферментативно малоактивна, сахаров не расщепляет, не обладает протеолитической активностью, не восстанавливает нитратов.Антигены
Антигенная структура бактерий рода Bordetella довольно сложная. У них выявлено 14 антигенных компонентов, или агглютиногенов. Родовым является агглютиноген 7. Видоспецифический агглютиноген для возбудителя коклюша - агглютиноген 1, для В. parapertussis - 14, для В. bronchiseptica - 12. Кроме агтлютиногена 1 у В. pertussis имеются другие агглютиногены, из которых наиболее часто встречаются 2 и 3. По содержанию этих агтлютиногенов выделяют 4 серовара.Патогенность и патогенез
К факторам вирулентности относится способность возбудителя к адгезии за счет пилей на эпителиоцитах респираторного тракта. С пилями связан филаментозный гемагглютинин, склеивающий В. pertussis с другими бактериями с образованием биопленок, состоящих из разных микробов. Образует белковые токсины, прочно связанные с цитоплазмой:трахеальный токсин (функциональный блокатор), вызывающий раздражение нервных рецепторов слизистой оболочки дыхвтельных путей, что приводит к возникновению приступов кашля. Токсинемия приводит к сосудистому спазму мелких бронхов, судорожному подергиванию вследствие его воздействия на дыхательный и сосудистый центры; кроме того, токсин активирует аденилатциклазную систему и накопление цАМФ, что приводит к нарушению водно-солевого обмена;дермонекротоксин, действующий на клетки миокарда за счет АТФ-азной активности. Отмечается гистаминосенсибилизирующее и лейкоцитозстимулирующее действие этих токсинов.Способность В. pertussis к пенетрации в эпителиоциты, где они сохраняются длительное время, а также незавершенный фагоцитоз в результате их выживания в макрофагах. Капсульный полисахарид защищает бактерии от фагоцитоза. Все гены, контролирующие патогенность, содержатся в одном опероне. Токсическое действие возбудителя приводит к раздражению нервных рецепторов слизистой оболочки респираторного тракта, кашлю и возбуждает дыхательный центр, вследствие чего наступает спазм мелких бронхов.Иммунитет
При коклюше имеет место гуморальный иммунный ответ, сопровождающийся формированием напряженного гуморального иммунитета. Повторные заболевания не отмечены.Экология и эпидемиология
Бордетеллы коклюша и паракоклюша являются обитателями верхних отделов респираторного тракта. В. bronchiseptica обитаег в дыхательных путях собак и других животных. Источником инфекции являются больные дети и бактерионосители. Бордетеллы быстро погибают в воздухе. Заражение происходит воздушно-капельным путем при непосредственном общении с больным ребенком или носителем.Коклюш и паракоклюш
Коклюш (коклюш) - острая, преимущественно детская инфекционная болезнь, вызываемая Bordetella pertussis, характеризуется воздушно-капельным механизмом передачи, катаральным воспалением дыхательных путей и приступами спазматического кашля с репризами. Bordetella parapertussis и Bordetella bronchiseptica вызывают подобные коклюша, но легким течением заболевания. Все три вида бордетел сходны между собой и относятся к одному роду. Это мелкие грамотрицательные овоидные палочки, часто окрашиваются биполярно.Возбудители выделяются со слизью и мокротой преимущественно в катаральный и реже в спазматический периоды. В связи с наличием стертых и атипичных форм, сходством симптомов решающее значение для их диагностики имеют лабораторные методы исследования. Микробиологический анализ проводят одновременно на выделение всех трех возбудителей.Взятие исследуемого материала
Слизь с задней стенки глотки берут стерильным задньоглотковим ватным тампоном желательно во время приступа кашля с обязательным использованием шпателя. При использовании тампонов на тонкой (напр. нихромовая) Дротинцы забирать материал можно и через нижние носовые ходы.При немедленном посеве используют сухой тампон. Если это невозможно - тампон предварительно смачивают раствором алгинат кальция или изотоническим раствором хлорида натрия, поскольку вата подавляет рост Bordetella pertussis. Взятый материал необходимо доставить в лабораторию в течение 2-4-х часов, оберегать его от переохлаждения.Еще лучше взять материал от больного с помощью "кашлевых пластинок". Для этого во время кашля открывают чашку Петри с питательной средой и держат ее на расстоянии 4-8 см перед ртом и носом больного в течение 6-8 кашлевых толчков.Для исследования можно брать мокроты (слизи), отсасывая его шприцом с резиновой трубкой с надгортанных зоны.Основными методами лабораторной диагностики коклюша является бактериологический и серологический. Для экспресс-диагностики, особенно в ранний период болезни, используют реакцию иммунофлюоресценции. Для этого мазки из исследуемого материала обрабатывают специальными флуоресцентными сыворотками и исследуют под люминесцентным микроскопом. Рассматривают 50 полей зрения. Положительным результат считают тогда, когда в поле зрения выявляют 2-3 бактериальные клетки, светящиеся.Бактериологическое исследование
Для выделения возбудителя используют такие традиционные среды: картофельно-глицериновый агар с кровью кролика (Борде-Жангу), коммерческий селективно-угольный агар (КВА) или молочно-кровяной агар. Для подавления роста грамположительной микрофлоры дыхательных путей к сред рекомендуют добавлять пенициллин. При посеве методом "кашлевых пластинок" антибиотик наносят на поверхность агара в объеме ОД мл (10 ЕД) и равномерно втирают шпателем. При посеве тампоном делают сначала штрих в виде центральной дорожки, а затем через нее перпендикулярно штрихами петлей. Для увеличения частоты выделения возбудителя посевы проводят одновременно на 2 чашки (одна без пенициллина). Выращивание проводят при 37 ° С в течение трех-пяти суток.Колонии на среде исследуют под стереоскопическим микроскопом или с помощью лупы. Они мелкие, выпуклые, блестящие, сероватого цвета, напоминающие капли ртути или перламутр. На среде Борде-Жангу вокруг колоний возникает небольшая зона гемолиза. Колонии Bordetella parapertussis несколько больших размеров коричневого цвета. Из типичных колоний изготовляют мазки? окрашивают по Граму и микроскопируют. Одновременно ставят реакцию агглютинации на стекле с коклюшным и паракоклюшнимы сыворотками в разведении 1:10. При положительном результате выделяют чистую культуру бордетел и проводят его идентификацию по ряду признаков.Бордетелы не ферментируют углеводов, не образуют индола, нитраты восстанавливает только Bordetella bronchiseptica. Основное значение при идентификации имеют особенности роста и реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными и, при возможности, с адсорбированными монорецепторными сыворотками к антигенам 1, 12, 14. С целью идентификации выделенных культур (даже на этапе образования колоний) можно применить реакцию непрямой гемагглютинации с эритроцитарным антительным диагностикумом.Серологическое исследование
Серологическое исследование проводят в основном для ретроспективной диагностики или в тех случаях, когда культура бордетел не выделена. Антитела к возбудителям образуются на третьей неделе болезни и позже. Для их выявления используют реакции агглютинации, связывания комплемента и особенно непрямой гемагглютинации. В связи с массовыми прививками детей против коклюша, все серологические реакции необходимо ставить методом парных сывороток. Диагноз подтверждают лишь при 4-кратном нарастании титра антител в динамике. У детей первых двух лет жизни серологические реакции часто бывают отрицательными.Аллергические пробы
Аллергические пробы путем введения внутрикожно 0,1 мл аглютиногена (10 ЕД) проводят чаще при массовых эпидемиологических обследованиях.Профилактика и лечение
Для вакцинопрофилактики используют тривакцину АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная), содержащую убитые коклюшные бактерии в 1 фазе (S-форме). Для лечения используют противококлюшный иммуноглобулин и антибиотики: тетрациклины, макролиды (эритромицин). Оглавление темы "Франциселлы. Возбудитель туляремии. Бруцеллы. Бруцеллёз. Бордетеллы. Возбудитель коклюша.":Bordetella pertussis - мелкая овоидная палочка, размером 0,2-0,5x1,0-1,2 мкм. Неподвижна, образует капсулу. Клетки возбудителя коклюша плохо окрашиваются по Граму, предпочтительно использовать толуидиновый синий, выявляющий биполярные метахро-матические гранулы (клеточные липоиды).
Коклюшная палочка - строгий аэроб; каталаза-положительна. Углеводы практически не ферментирует, требовательна к питательным средам. Кроме того, росту возбудителя коклюша препятствуют накапливающиеся в среде жирные кислоты, ингибирующие их рост. Поэтому в культуральные среды вносят адсорбенты - активированный уголь, крахмал, альбумин и др.
Наиболее часто используют агар Борде-Жангу и казеиново-угольный агар (КУА).
Через 3-5 сут на агаре Борде-Жангу
коклюшная палочка
образует небольшие (1 мм в диаметре) сероватые, выпуклые и блестящие колонии, напоминающие капельки ртути или жемчужины, окружённые зоной слабого гемолиза.
На КУА колонии возбудителя коклюша
блестящие, серовато-кремового цвета. При изменении состава питательной среды или условий культивирования бордетеллы быстро изменяют тип роста и антигенные свойства. Переход от S-формы (I фаза) к R-форме (IV фаза) происходит через промежуточные II и Ш фазы и сопровождается изменением набора Аг и потерей вирулентных свойств.
В жидких средах (20% кровяной бульон) бактерии дают незначительное помутнение, образуют плёнку (иногда со спускающимися вниз отростками типа сталактитов); к 10-14-м суткам культивирования образуют осадок, среда при этом становится прозрачной.
- Вернуться в оглавление раздела " "
Возбудители этих заболеваний относятся к роду Bordetella.
1. Bordetella pertussis - возбудитель коклюша, описан Борде и Жангу в 1906 г.
2. Bordetella parapertussis - возбудитель паракоклюша, описан Элдеринг и Кондрик в 1937 г.
3. Bordetella bronchiseptica - вызывает заболевание у животных. У человека эти бактерии вызывают бронхопневмонию с коклюшеподобным кашлем. Впервые у человека это заболевание описано Брауном в 1926 г. (встречается редко).
Морфология . Бактерии коклюша - мелкие палочки овоидной формы, 0,3-0,5 × 1-1,5 мкм. Возбудитель пара-коклюша несколько большей величины. Оба микроба не имеют спор, неподвижны. При специальной окраске видна капсула. Грамотрицательны. Более интенсивно окрашиваются по полюсам.
На ультрасрезах видны капсулоподобная оболочка, зерна валютина, в нуклеиде - вакуоли.
Культивирование . Возбудители коклюша и паракоклюша - аэробы. Прихотливы к питательным средам. Для их выращивания применяют среду Борде - Жангу (глицериново-картофельный агар с кровью). В настоящее время пользуются средой КУА (казеиново-угольный агар) - это полусинтетическая среда без крови. Источником аминокислот здесь является гидролизат казеина. Среда КУА отличается от среды Борде - Жангу более простым и доступным методом изготовления.
Для угнетения роста посторонней флоры к среде добавляют пенициллин по 0,25 - 0,5 ME на 1 мл среды или метициллин - 2,5-4 мкг на 1 мл. Пенициллин можно наносить на поверхность среды в чашках.
Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 35-36° С, рН среды 6,8-7,4. Посевы необходимо предохранять от высыхания, для этого в термостат ставят сосуд с водой.
Колонии В. pertussis появляются через 48-72 ч, а В. parapertussis - через 24-48 ч.
На среде КУА колонии В. pertussis мелкие 1-2 мм в диаметре, В. parapertussis несколько крупнее. Колонии обоих микробов блестящие, серовато-кремового цвета (на казеиново-угольном агаре они напоминают капельки ртути). При снятии колоний остается вязкий, сметанообразный след. При изучении колоний в стереоскопическом микроскопе виден световой конус (колонии отбрасывают тень). Когда меняется положение светового источника (электролампочки) тень меняет положением Наличие светового конуса (хвостика) имеет диагностическое значение.
В. parapertussis образует фермент тирозиназу, поэтому в средах, содержащих тирозин, происходит его расщепление и среда окрашивается в коричневый цвет. Изменение цвета среды является дифференциально-диагностическим признаком.
В жидкой среде бактерии коклюша и паракоклюша образуют равномерную муть и придонный осадок. На агаре с кровью они дают зону гемолиза.
Свежевыделенные культуры чаще всего имеют гладкую S-форму (I фаза). При культивировании в неблагоприятных условиях или в материале, взятом в поздние сроки заболевания, могут появиться диссоциированные формы (II-IV фазы).
Ферментативные свойства . Возбудители коклюша не расщепляют углеводы и не ферментируют белки. Бактерии паракоклюша образуют ферменты уреазу и тирозиназу.
Бактерии коклюша и паракоклюша продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, плазмокоагулазу и лецитиназу.
Токсинообразование . В опытах на животных у коклюшной палочки были выявлены четыре типа токсина белковой природы: 1) термолабильный дермонекротический токсин; 2) термостабильный эндотоксин; 3) лейкоцитозостимулирующий фактор (стимулирующий лейкоцитоз); парентеральное введение его вызывало гибель экспериментальных животных; 4) гистаминсенсибилизирующий фактор - при введении его мышам у них повышалась чувствительность к гистамину.
Первые два типа токсина свойственны и возбудителю паракоклюша.
Антигенная структура . У бактерий рода Bordetella сложная антиренная структура. Наиболее важными антигенами для лабораторной диагностики являются агглютиногены. Родовым агглютиногеном является 7. Видоспецифическим агглютиногеном для бордетелл коклюша является 1, для бордетелл паракоклюша - 14, для бордетелл бронхосептика - 12.
Моноспецифические сыворотки 1, 14, 12 используются для дифференциации видов (сыворотки выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи).
Кроме видоспецифических антигенов, у представителей Bordetella имеются и другие агглютиногены, разное сочетание которых определяет серовар (табл. 48.).
По сочетанию трех главных агглютиногенов 1,2,3, определяемых в реакции агглютинации с моноспецифическими сыворотками, В. pertussis различают три серовара: 1,2,3; 1,2,0; 1,0,3.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Возбудители коклюша и паракоклюша мало устойчивы. При температуре 56° С они погибают через 20-30 мин. Низкие температуры также губительно на них действуют. Прямой солнечный свет убивает их через 1-2 ч; УФ-лучи - через несколько минут. В сухой мокроте эти бактерии сохраняются в течение нескольких часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их быстро.
Оба вида микробов мало чувствительны к антибиотикам, не чувствительны к пенициллину.
Восприимчивость животных . В естественных условиях животные не восприимчивы к возбудителям этого рода. В экспериментальных условиях удается воспроизвести коклюш у обезьян и молодых собак, вызвать гибель мышей.
Источники инфекции . Больной человек. Особенно заразны больные в катаральном периоде.
Пути передачи . Воздушно-капельный путь. Роль различных предметов мало вероятна ввиду неустойчивости коклюшных бактерий во внешней среде.
Патогенез . Возбудители коклюша и паракоклюша вызывают острое заболевание, сопровождающееся конвульсивным кашлем. Попав на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, бактерии размножаются там и частично разрушаются. Выделившийся токсин действует на центральную нервную систему, раздражает нервные рецепторы слизистой оболочки верхних дыхательных путей, что приводит в действие кашлевой рефлекс. В результате возникают приступы судорожного кашля. В процессе заболевания наблюдается несколько периодов: катаральный, спазматического кашля и разрешения процесса.
Иммунитет . После перенесенного заболевания вырабатывается стойкий иммунитет, который обусловливается гуморальными и клеточными факторами.
Профилактика . Выявление и изоляция больных. Ослабленным детям, находившимся в контакте с больным коклюшем, вводят иммуноглобулин. Основные меры специфической профилактики - иммунизация детей АКДС (коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной). Вакцину вводят троекратно в возрасте до 6 мес с последующей ревакцинацией.
Лечение . В ранних стадиях заболевания применяют противококлюшный иммуноглобулин. Для лечения используют эритромицин и ампициллин.
Контрольные вопросы
1. Опишите морфологические свойства возбудителя коклюша и паракоклюша.
2. На каких средах и каков характер роста коклюшных и паракоклюшных микробов?
3. Устойчивость возбудителей коклюша и паракоклюша во внешней среде.
4. Дифференциальные признаки возбудителей коклюша и паракоклюша.
5. Источники заражения, пути передачи, патогенез коклюша.
Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя и дифференциация возбудителей коклюша от паракоклюша.
Материал для исследования
Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.
Основной метод исследования
Микробиологический
Ход исследования
Второй - третий дни исследования
Посевы вынимают из термостата и просматривают, пользуясь лупой или стереоскопическим бинокулярным микроскопом. При наличии подозрительных колоний их выделяют на КУА: в чашках Петри, разделенных на сектора, или в пробирках. Посевы ставят в термостат. Если колоний много, из части их можно сделать мазки, покрасить и посмотреть под микроскопом. При наличии мелких грамотрицательных палочек ставят пробную реакцию агглютинации с моноспецифической родовой сывороткой 7. Положительная реакция агглютинации свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду Bordetella. Для определения вида бордетелл ставят реакцию агглютинации с моноспецифическими видовыми сыворотками 1 и 14. Реакции ставят на предметном стекле. Положительный результат реакции агглютинации позволяет дать предварительный ответ.
Четвертый день исследования
Посевы вынимают из термостата и просматривают: сначала невооруженным глазом, обращая внимание на Цвет среды (нет ли коричневого окрашивания), затем изучают рост при помощи стереоскопического микроскопа.
При наличии подозрительных колоний из выделенной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и изучают под микроскопом. Затем повторно (из чистой культуры) ставят реакцию агглютинации на стекле с моноспецифическими сыворотками 1,2,3 и 14. Результаты агглютинации дают возможность отдифференцировать В. pertussis от В. parapertussis, и если это - В. pertussis, то определить серовар: 1-й серовар - (1,2,3), 2-й серовар - (1,2,0), 3-й серовар - (1,0,3). Определение серовара имеет эпидемиологическое значение.
Для окончательной идентификации выделенной культуры (при положительной агглютинации с моноспецифическими сыворотками) ставят пробу на наличие уреазы и производят посев на скошенный агар, содержащий 0,1% тирозина (см. рис. 49).
Проба на уреазу . В маленькую пробирку наливают 0,3-0,4 мл 2% раствора мочевины, вносят петлю культуры и добавляют 2-3 капли фенолфталеина. Пробирку встряхивают и ставят в термостат. Учитывают реакцию через 2 и 24 ч. Бактерии коклюша не изменяют цвет среды. Бактерии паракоклюша обладают ферментом уреазой, который расщепляют мочевину с образованием аммиака. Аммиак изменяет индикатор и среда окрашивается в красный цвет.
Проба с тирозином . На скошенный МПА в пробирках с 0,1% тирозином засевают выделенную культуру и ставят в термостат. На следующий день вынимают пробирку из термостата и просматривают ее. Наличие роста в пробирке и окрашивание среды в коричневый цвет свидетельствуют о росте возбудителей паракоклюша. Возбудители коклюша на этой среде не растут.
Пятый день исследования
При отсутствии подозрительных колоний дают отрицательный ответ.
Ускоренная диагностика
При бактериологическом методе исследования ответ можно получить через 3-4 дня.
1. Применение иммунно-люминесцентного метода позволяет дать ответ через несколько часов после взятия материала путем непосредственного выявления микробов в мазках, сделанных с тампонов.
2. Из посевов на среде КУА при отсутствии видимого роста можно сделать мазок-отпечаток: для этого стерильной резиновой пробкой дотрагиваются до места посева и переносят отпечаток на предметное стекло. Мазок-отпечаток изучают методом иммунофлюоресценции. В мазках обнаруживаются бактерии В. pertussis или В. parapertussis.
Контрольные вопросы
1. Что служит материалом для исследования при подозрении на коклюш?
2. Какие методы сбора материала применяют для выявления возбудителя при подозрении на коклюш?
3. Что прибавляют к среде для подавления роста посторонней микрофлоры?
1. Возьмите 10 чашек со средой КУА, флакон пенициллина, содержащий 300000 ЕД. Сделайте разведение пенициллина таким образом, чтобы в 0,1 мл содержалось 7,5 ЕД. Сделайте расчет на общее количество среды.
2. Соберите отделяемое носоглотки друг у друга и сделайте посев на среду КУА.
3. Возьмите у преподавателя чашку с культурой бактерий коклюша или паракоклюша, изучите характер колоний с помощью стереоскопического микроскопа. Подозрительные колонии посейте на сектор среды КУА (выделение чистой культуры).
4. Возьмите у преподавателя чистую культуру возбудителей коклюша или паракоклюша, выросшую на секторе среды КУА, и поставьте реакцию агглютинации с диагностической коклюшной сывороткой.
При наличии положительной реакции агглютинации поставьте пробу на уреазу и сделайте посев на среду с тирозином (0,1%).
Питательные среды
КУА. Среду готовит Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалея. Готовая среда КУА черного цвета, конденсационная вода не должна содержать частиц угля. В готовом виде среду можно сохранять продолжительное время (до месяца и более), предохраняя ее от высыхания.