Оборудование и реактив: хроматографическая бумага; хроматографическая камера; фотоэлектроколориметр; ножницы; пластинки стеклянные (3´32 см) - 3 шт.; держатель для хроматограмм; сушильннй шкаф; микропипетки; пробирки с притертыми пробками; бюретка на 25 мл; стандартная смесь аминокислот; испытуемая смесь аминокислот; бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 15:3:7; 1 %-ный раствор нингидрина в 95 %-ном ацетоне; этиловый спирт (75%-ный), насыщенный медным купоросом.
Выполнение работы
Берут лист хроматографической бумаги размером 18´28 см и на расстоянии 3 см от его короткого края проводят простым карандашом горизонтальную линию. Затем ее делят на неравные отрезки в соответствии с прилагаемой схемой и выделяют стрелками границы нанесения стандартной и испытуемой смесей и делают соответствующие надписи простым карандашом.
Бумагу укрепляют над поверхностью стола и на линию старта, ограниченную стрелками, наносят сначала стандартную смесь при помощи специальной микропипетки тонкой линией, пока весь раствор из микропипетки не будет перенесен на стартовую линию (микропипетку заполняют на 2-3 см). Измеряют массу нанесенного раствора, для чего взвешивают пипетку, заполненную стандартной смесью (до нанесения раствора), и пустую (после нанесения раствора). На бумагу обычно наносят 0,02-0,03 г стандартного раствора. Затем заполняют чистую пипетку испытуемой смесью аминокислот (выданной преподавателем для исследования), взвешивают ее и наносят смесь на линию старта с соответствующей пометкой.
Приготовленную хроматограмму помещают в хроматографическую камеру с предварительно налитой в нее системой растворителей для разделения смеси аминокислот, например, смеси бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:3:7. Разделение ведут методом восходящей хроматографии, пока линия фронта не дойдет на 2-3 см до верхнего края хроматографической бумаги (линия финиша). После этого хроматограмму вынимают из камеры и верхний конец бумаги немедленно вставляют в держатель, сделанный из трех скрепленных резиновым кольцом стеклянных палочек, и помещают на 20 мин в вытяжной шкаф для удаления из бумаги растворителей.
Рис. 8. Схема расположения аминокислот на хроматограмме:
А - точка нанесения смеси аминокислот; I - цистин и цистеин;
2 - лизин; 3 - гистидин; 4 - аргинин; 5 - аспарагиновая кислота,
серии и глицин; 6 - глутаминовая кислота и треонин; 7 - аланин;
8 - пролин; 9 - тирозин; 10 - валин и метионин; II - триптофан;
12 - фенилаланин; 13 – лейцин и изолейцин
Высушенную хроматограмму обмакивают в 1 %-ном растворе нингидрина в ацетоне для обнаружения на ней положения пятен аминокислот. Затем хроматограмму помещают на 10 мин в вытяжной шкаф для удаления ацетона и переносят в сушильный шкаф, где оставляют ее на 15 мин при 70°С. Аминокислоты стандартной и испытуемой смесей обнаруживают в виде сине-фиолетовых пятен, расположенных цепочкой по направлению движения системы растворителей от линии старта к верхнему краю хроматограммы.
Идентификацию аминокислот, содержащихся в испытуемой смеси, ведут по совпадению на хроматограмме позиций, занимаемых аминокислотами стандартной и испытуемой смесей (рис. 8).
Для определения количественного содержания аминокислот в испытуемых смесях хроматограмму расчерчивают простым карандашом так, чтобы лежащие на одном уровне окрашенные зоны, соответствующие одной и той же аминокислоте, оказались заключенными внутри примерно одинаковых прямоугольников (рис. 9).
I II III IV
Рис. 9. Схема расположения аминокислот на хроматограмме:
I - смесь № I; II - смесь № 2; 1У - смесь №3; Ш - стандартная
смесь аминокислот
Очерченные участки бумага вырезают и помещают в пробирки, номера которых должны соответствовать номерам пятен на хроматограммах. В каждую пробирку наливают из бюретки по 10 мл 75 %-ного раствора этилового спирта, насыщенного сульфатом меда (к 500 мл этилового спирта добавляют 0,2 мл насыщенного раствора сульфата меди). Пробирку закрывают пробкой и, периодически перемешивая, добиваются полного перехода кирпично-красной окраски (медной соли сине-фиолетового Руэмана) с бумаги в раствор. На это уходит 15-20 мин. Абсорбцию (оптическая плотность) стандартного и испытуемого растворов измеряют на фотоэлектрокалориметре с зеленым светофильтром (540 нм). В поток сравнения устанавливают кювету с 75%-ным раствором этилового спирта с сульфатом меди.
Количественное содержание аминокислот в исследуемом растворе рассчитывают по соотношению экстинкций исследуемой и стандартной проб.
Пример расчета . Допустим, что в стандартной смеси содержится 1,8 мг глицина в I мл, на стартовую полосу нанесено 0,02 г этого стандартного раствора. Следовательно, на хроматограмму поступило (1,8×0,02) = 0,036 мг глицина. Условимся далее, что абсорбция окрашенных растворов составила 0,288 для стандарта и 0,336 для неизвестной смеси. Тогда содержание глицина в исследуемой смеси, нанесенной на хроматограмму, составит (36´0,336): 0,288=42 мкг. Если далее принять, что исследуемая смесь нанесена на хроматограмму в количестве, например 0,0250 г, то содержание глицина в 1 мл исследуемого раствора составит (42:0,0250) = 1680 мкг, или 1,68 мг/мл.
Оформите результаты собственного эксперимента, сделайте по ним выводы.
Лабораторная работа №15
Разделение ионов Fe 3+ , Co 2+ , Ni 2+
Аминокислоты можно обнаружить с помощью цветных реакций: нингидриновой, ксантопротеиновой, Фоля, Милона, биуретовой пробы и др. Эти реакции неспецифичны, т.к. основаны на обнаружении отдельных фрагментов в структуре аминокислот, которые могут встречаться и в других соединениях.
Нингидриновая реакция , цветная реакция, применяемая для качественного и количественного определения аминокислот, иминокислот и аминов. При нагревании в щелочной среде нингидрина (трикетогидринденгидрата, С 9 Н б О 4) с веществами, имеющими первичные аминогруппы (-NH 2), образуется продукт, который имеет устойчивую интенсивную сине-фиолетовую окраску с максимальным поглощением около 570 нм . Т. к. поглощение при этой длине волны линейно зависит от числа свободных аминогрупп, нингидриновая реакция послужила основой для их количественного определения методами колориметрии или спектрофотометрии. Эта реакция используется также для определения вторичных аминогрупп (>NH) в иминокислотах - пролине и оксипролине; в этом случае образуется продукт ярко-жёлтого цвета. Чувствительность - до 0,01%. Современный автоматический аминокислотный анализ проводят, сочетая ионообменное разделение аминокислот и количественное определение их с помощью нингидриновой реакции. При разделении смесей аминокислот методом бумажной хроматографии позволяет определять каждую аминокислоту в количестве не менее 2-5 мкг.
По интенсивности окраски можно судить о количестве аминокислот.
Эта реакция положительна не только со свободными аминокислотами, но и пептидами, белками и др.
Ксантопротеиновая реакция позволяет обнаружить ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, гистидин, триптофан), основана на реакции электрофильного замещения в ароматическом ядре (нитрование).
При действии концентрированной азотной кислоты, например, на тирозин образуется продукт, окрашенный в желтый цвет.
Реакция Фоля. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Описание опыта. В пробирку наливают 1 мл раствора цистина, прибавляют 0,5 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают до кипения, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):
Реакция Циммермана. Это реакция на аминокислоту глицин.
Описание опыта. К 2 мл 0,1%-го раствора глицина, доведенного добавлением 10%-го раствора щелочи до рН = 8, приливают 0,5 мл водного раствора о-фталевого диальдегида. Реакционная смесь начинает медленно окрашиваться в ярко-зеленый цвет. Через несколько минут выпадает зеленый осадок.
Реакция на триптофан. Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:
По аналогичной схеме протекает и реакция триптофана с формальдегидом.
Реакция Сакагучи. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с α-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:
Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра α-нафтола:
Описание опыта. В пробирку наливают 2 мл 0,01%-го раствора аргинина, затем добавляют 2 мл 10%-го раствора едкого натра и несколько капель 0,2% спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромита и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.
Биуретовая реакция – используется как цветная реакция на белки. В щелочной среде в присутствии солей меди(II) они дают фиолетовое окрашивание. Окраска обусловлена образованием комплексного соединения меди(II), за счет пептидной группы -СО-NH- , которая характерна для белков. Свое название эта реакция получила от производного мочевины - биурета, который образуется при нагревании мочевины с отщеплением аммиака:
Кроме белков и биурета такое же окрашивание дают и другие соединения, содержащие -эту группу: амиды, имиды карбоновых кислот, а также соединения, содержащие в молекуле группы -CS-NH- или =CH-NH-. Также реакцию дают белки, некоторые аминокислоты, пептиды, биурет и средние пептоны.
Цвет комплекса, получаемый при биуретовой реакции с различными пептидами, несколько отличается и зависит от длины пептидной цепи. Пептиды с длиной цепи от четырех аминокислотных остатков и выше образуют красный комплекс, трипептиды – фиолетовый, а дипептиды – синий.
кетонная форма полипептида
енольная форма полипептида
При взаимодействии полипептида с Cu (OH) 2 образуется комплекс, строение которого можно показать так.
В данной статье будут рассмотрены методы определения аминокислот, применяющиеся не только при анализе продуктов, но в биохимии и фармацевтическом анализе.
Общее количество аминокислот может быть проведено фотометрическим методом, основанным на определении аммиака, полученного из аминокислот по методу Кьельдаля.
Реакция с 1-нафтолом. Для определения аргинина, гистидина, тирозина предложена реакция с 1-нафтолом. В присутствии гипохлорита натрия (NaOCl) раствор окрашивается в красный цвет. Пробу раствора в 50% этаноле, содержащую аминокислоту, охлаждают льдом и добавляют 10% раствор NaOCl и раствор нафтола. Продукт реакции окрашен в красный цвет (l max = 550 нм). По интенсивности окраски полученного раствора определяют содержание аминокислот.
Биуретовая реакция . Одной из важнейших реакций, используемых для определения аминокислот, является биуретовая реакция. Реакция осуществляется прибавлением к щелочному раствору биурета разбавленного водного раствора соли меди (II). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соединения.
В биуретовую реакцию вступают соединения, содержащие не менее 2-х амидных группировок или аминогидроксиэтиленовую группу, а также амиды и имиды аминокислот. Эту реакцию дают белки и концентрированные растворы аминокислот и амидов. Разбавленные растворы аминокислот не дают биуретовой реакции и поэтому реакцию можно использовать для установления конца гидролиза белка. Реакцию применяют также для качественного и количественного определения белка. На биуретовой реакции основаны используемые в клинико-диагностических лабораториях методики определения белка в крови и других биологических жидкостях.
Нингидриновая реакция. Второй важнейшей реакцией, используемой для определения аминокислот, является нингидриновая реакция – цветная реакция на a-аминокислоты, которую осуществляют нагреванием последних в щелочном растворе избытка нингидрина.
Нингидрин осуществляет окислительное декарбоксилирование a-аминокислот с образованием аммиака, углекислого газа и альдегида, содержащего на один атом углерода меньше, чем исходная аминокислота. Восстановленный нингидрин далее реагирует с высвободившимся аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя с аммиаком окрашенный продукт конденсации.
Образующееся соединение (пигмент) имеет фиолетово-голубую окраску (l мах = 570 нм). Образование этого окрашенного соединения используется в количественном тесте на a-аминокислоты, с помощью которого можно обнаружить аминокислоты, даже их количество не превышает 1 мкг.
Пролин и гидроксипролин, у которых нет a-аминогруппы, в реакции с нингидрином образуют производные желтого цвета (l мах = 440 нм). Реакция не специфична, т.к. окрашенный продукт с нингидрином дают также аммиак и соединения, содержащие аминогруппу (амины, белки, пептиды). Однако с этими соединениями не выделяется CO 2 . Выделение углекислого газа характерно только для a-аминокислот. Реакция используется для колориметрического количественного определения a-аминокислот, в том числе в автоматических аминокислотных анализаторах (измерение объема СО 2).
Нингидриновая реакция используется для определения глицина, изолейцина, лейцина; менее интенсивную окраску дают серин, фенилаланин, цистеин, тирозин, триптофан и др.
Образующиеся продукты характеризуются достаточно интенсивной окраской (e = 1,8–3,3·10 4), но окрашенные продукты нестабильны. Интенсивность окраски быстро уменьшается. Для стабилизации добавляют CdCl 2 . Он образует устойчивые комплексы с образующимися соединениями. Хлорид кадмия также ускоряет реакцию.
Аминокислоты и некоторые другие соединения, содержащие аминогруппу, конденсируются в щелочной среде с 1,2-нафтохинон – 4-сульфоксилотой с образованием окрашенных в красный, желтый, оранжевый цвет производных 1,2-нафтохинонмоноимина.
Реакция используется для определения a-аминоксилот (валин, изолейцин, лейцин, и др.).
Для определения триптофана может быть использована реакция с 4-диметиламинобензальдегидом. Продукт реакции окрашен в фиолетовый цвет и по интенсивности окраски определяют содержание триптофана в анализируемом растворе.
Следует отметить, однако, что данная реакция в анализе пищевых продуктов используется редко.
Для количественного определения аминокислот, содержащих серу, используется броматометрический метод, основанный на следующей реакции:
Раствор цистеина в 1% растворе NaOH вливают в колбу с притертой пробкой, добавляют 0,1 н. раствор бромата калия, сухой бромид калия и подкисляют 10%-ной HCl.
BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O
Образующийся в результате реакции бром, количество которого эквивалентно количеству бромата калия, реагирует с аминокислотой. Через 10 мин прибавляют йодид калия, который вступает в реакцию с непрореагировавшим бромом, и титруют выделившийся йод 0,1 н. раствором тиосульфата натрия с крахмалом в качестве индикатора.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Количество тиосульфата, пошедшего на титрование, эквивалентно количеству брома, не вступившего в реакцию с аминокислотой. По разнице между количеством добавленного бромата калия и тиосульфата находят количество брома, пошедшего на реакцию с аминокислотой, а значит и количество аминокислоты.
Метионин определяют аналогично. Метионин при этом окисляется до сульфона:
Эта реакция при определенных условиях позволяет очень точно определить содержание метионина.
И белков
Известно, что все 20 разновидностей канонических α-аминокислот имеют однотипную структуру, с тремя вариантами функциональных групп (рис. 3.3). К сожалению, реакции на амино- и карбоксигруппы малоспецифичны, т.к. соответственно, свойственны всем аминам, ряду амидов и карбоновых кислот. То же относится и к большинству их радикалов = R, 10 из которых неполярны, то есть представлены алифатическими = углеводородными группами, большинство которых химически инертно. Относительно низка и специфичность большинства R полярных аминокислот, в которых встречаются спиртовые (Сер, Тре, Тир) амидные (Асн, Глн) и карбоксигруппы (Асп, Глу). Более активны аминогруппа (Лиз), имидазол Гис и гуанидиногруппа Арг, а максимальна активность тиогруппы Цис. Поэтому наибольшее практическое значение в качественном и количественном анализе α-аминокислот, в том числе и в аминокислотных анализаторах, получила универсальная нингидриновая реакция, специфичная для одновременного присутствия у α-С атома, как амино-, так и карбоксигруппы.
Рис. 3.3. Общие формулы структуры α-аминокислот и продукта их полимеризации. Пояснения в тексте.
Полимеризация α-аминокислот в структуру пептидов и белков (рис. 3.3) сохраняет все типы их R, но:
1. Нингидриновая реакция становится отрицательной, т.к. за исключением N- и C-концевых, α-амино- и α-карбоксигруппы расходуются на образование пептидных связей. Положительная нингидриновая реакция с белком, скорей свидетельствует о присутствии примесей аминокислот в препарате или посуде.
2. Для всех пептидов и белков специфична биуретовая реакция на пептидную группу, отсутствующую в мономерных аминокислотах.
3. Из более специфических реакций на R аминокислот, бывают полезны: ксантопротеиновая реакция с концентрированной азотной кислотой, на ароматические R Фен, Тир, Три; реакция с изатином на пятичленный цикл Про, а также реакции на имидазольный R Гис, тиогруппу Цис и гуанидиногруппу Арг. Важно учитывать, что часть этих R скрыта внутри белковых глобул и потому, качественные реакции на них ослаблены. Поэтому, перед их проведением, белки обычно денатурируют тем или иным способом.
4. В отличие от истинных растворов аминокислот, коллоидным растворам белков свойственны осадочные реакции , связанные с разрушением их гидратных оболочек и, вследствие этого, снижением их растворимости под действием водоотнимающих средств: нейтральных солей = высаливание, метанола = МеОН, этанола = EtОН, ацетона, мочевины и др. агентов.
Выполняя качественные реакции, следует:
1. Тщательно соблюдать правила пожарной безопасности и работ с концентрированными кислотами и щелочами = ЕЖ.
2. Промаркировать стеклографом или фломастером 2 ряда пробирок и поместить в один из них не более 0,5 мл (2-5 капель) 1 % раствора аминокислоты, а в другой – примерно тот же объем 1 % раствора белка.
3. В пару пробирок с растворами аминокислоты и белка, параллельно добавить по 3-5 капель соответствующих реактивов и, провести остальные процедуры, указанные для соответствующей реакции.
4. При необходимости нагрева пробирок – снять крышку тигля и поджечь спичкой сухое горючее. Затем, зажать пробирку в держатель, примитивная конструкция которого, очень ненадежна. Поэтому лучше обернуть пару пробирок сложенным в полоску листком бумаги и, придерживая их большим пальцем, равномерно пропускать нижние половины пробирок через пламя, избегая направления горлышек на соседей и бурного вскипания раствора . Выполнив операцию, своевременно погасить пламя крышкой тигля.
5. Результаты опытов, в соответствии с шаблоном, оформлять на развороте лабораторной тетради в виде таблицы:
6. Обдумав полученные результаты и, завершив оформление протокола, вместе со штативом пробирок, предъявить их преподавателю для защиты.
1. Нингидриновая реакция. Основана на дезаминировании и декарбоксилировании α-аминокислот спиртовым раствором нинги-дрина:
Возникший аммиак, реагируя с двумя молекулами нингидрина, образует окрашенное производное, с максимумом поглощения при 540 нм (для Про – 440 нм).
Ход работы : К исследуемым образцам добавить по 3-5 капель 0,5 % спиртового раствора нингидрина. Пробирки со смесями аккуратно прогреть на пламени и через 2-3 мин зарегистрировать появление окраски.
2. Ксантопротеиновая реакция. Как уже сказано выше, основана на образовании нитропроизводных аминокислот с ароматическим R: Фен, Тир, Три.
Ход работы : Включив тягу вытяжного шкафа, в пару пробирок с исследуемыми растворами осторожно добавить по нескольку капель концентрированной азотной кислоты (HNO 3). Пробирки аккуратно прогреть на пламени, избегая направления горлышек на соседей, и зарегистрировать развитие окраски.
3. Нитропруссидная реакция. Основана на щелочном гидролизе серусодержащей аминокислоты цистеина, с выделением сульфида натрия (Na 2 S), дающего со свежеприготовленным раствором нитропруссида натрия, комплекс красного цвета.
Ход работы: В обе пробирки с 5-10 каплям исследуемых растворов добавить равный объём 20 % едкого натра и прокипятить не менее 3-5 мин. Добавить в пробирки по 3-5 капель раствора нитропруссида натрия и зафиксировать развитие окраски.
4. Биуретовая реакция. Основана на образовании в щелочной среде цветного комплекса пептидной связи с ионом Cu 2+ . Служит универсальным тестом для выявления пептидов и белков в растворах. Так как с ростом количества пептидных связей, интенсивность окраски раствора линейно нарастает, широко применяется для фотометрического определения концентраций белка.
Ход работы . В пробирки с 5-10 каплями исследуемых растворов добавить столько же 10 % раствора едкого натра. Хорошо перемешать и добавить по 2 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO 4). Пробы перемешать и через несколько минут зарегистрировать развитие окраски.
5. Проба с кипячением. Основана на тепловой денатурации белков.
Ход работы . Обе пробирки с исследуемыми растворами подкислить, не более, чем одной каплей 1 % раствора уксусной кислоты (AcOH) и нагреть до кипения. Прокипятив растворы 2-3 мин, зарегистрировать результаты и объяснить механизм явления.
6. Осаждение солями тяжелых металлов (Ме). Их денатурирующие свойства основаны на способности катионов тяжелых Ме реагировать с функциональными группами R молекулы белка: тио-, амино-, карбокси-, ароматическими. Также, их сильные анионы вызывают перезарядку ионогенных групп в молекулах белков, разрушая в них тем самым, ионные связи.
Ход работы . В обе пробирки с исследуемыми растворами добавить по нескольку капель 5 % раствора сульфата меди (CuSO 4). Зарегистрировать и объяснить полученные результаты.
7. Осаждение органическими кислотами. Основано на кислотной денатурации белков и образовании ковалентных производных тио-, амино- и ароматических групп R аминокислот с хлорорганикой.
Ход работы . В пробирки с исследуемыми растворами добавить по нескольку капель 10 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и, через несколько минут зарегистрировать результаты
Методы определения аминокислот
Аминокислоты являются биологически активными веществами, они играют большую роль в жизнедеятельности организма человека, их широко используют в качестве лекарственных средств . Часть из них являются незаменимыми и поступают в организм вместе с пищей. В настоящее время существует ряд методов количественного определения аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях, в пищевых продуктах.
Из всего многообразия методов количественного определения аминокислот в различных объектах, можно выделить четыре основные группы: хроматографические, спектрофотометрические, титриметрические и электрохимические методы анализа.
Хроматографические методы
За последние десятилетия достигнуты значительные успехи в области газожидкостной хроматографии аминокислот. Предложен метод с использованием микронабивных колонок, позволяющий за сравнительно короткое время разделять практически полностью 17 важных в биологическом отношении?-аминокислот .
Разработана методика определения аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии в образцах сыворотки, плазмы, мочи и спинномозговой жидкости, основанная на получении 2,3,4,5,6-пентафторбензоил-изобутиловых эфиров с последующим разделением на колонке из полидиметилсилоксана в режиме программирования температуры от 140°С до 250°С с пламенно-ионизационным детектором. Время хроматографического разделения составляет 28 мин. В результате исследований удалось разделить 27 аминокислот .
Несмотря на многообразие методик высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе аминокислот, наиболее экспрессным и доступным является обращено-фазовый вариант со спектрофотометрическим детектированием. Для успешного разделения и детектирования аминокислоты переводят в гидрофобные и поглощающие свет производные, то есть проводят предколоночную дериватизацию. В качестве реагентов для дериватизации применяют ортофталевый альдегид, нафталин-2,3-дикарбоксиальдегид, 9-флуоренилметилхлороформиат .
Разработана методика количественного определения L-цистина, L-глутаминовой кислоты и глицина в лекарственном препарате «Элтацин», обладающего антиоксидантной активностью в сочетании с антиангинальным эффектом . Глутаминовую кислоту и глицин определяли методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии после предколоночной дериватизации с реагентом ортофталевый альдегид / N-ацетил-L-цистеин. Дериватизация цистеина, по данным авторов, затруднена из-за нестабильности самой аминокислоты и образующихся производных. Поэтому, анализ цистеина проводили методом броматометрического титрования. Установлено, что присутствие в образце значительных количеств цистеина не мешает определению продуктов дериватизации глицина и глутаминовой кислоты с реагентом ортофталевый альдегид / N-ацетил-L-цистеин. Метод характеризуется высокой воспроизводимостью и точностью определения.
Исследована возможность использования 4,7-фенантролин-5,6-диона (фанхинона) в качестве флуорогенного реагента-метки для предколоночного образования его производных с целью разделения и количественного анализа аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Не обладающий собственной флуоресценцией, фанхинон реагирует с аминогруппами аминокислот (при 68 °С в течение 160 мин), образуя иминохинолы, флуоресценцию которых измеряют при длине волны 460 нм. Выделенные производные идентифицировали по Тпл, ИК-, масс-, и ПМР-спектрам. Высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили на хроматографе с флуоресцентным детектором и колонкой при градиентном элюировании смесями: раствор триэтиламина - фосфатный буфер (рН 3) - метанол. В качестве внутреннего стандарта использовали хинидин. Данный метод достаточно перспективен в условиях крупных лабораторий и может быть предложен для анализа аминокислот в готовых лекарственных формах.
Разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии с потенциометрическим биосенсором для количественного определения лизина. Биосенсор сконструирован прикреплением, содержащей лизиноксидазу, мембраны к ионно-селективному NH4+ - электроду. Генерируемые при ферментативной деградации лизина ионы аммония детектируют потенциометрически. Разработан хроматоденситометрический экспресс-метод анализа в культуральных жидкостях триптофана. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках «Сорбфил». Хроматографию осуществляли в системе пропанол-2 - 25 % раствор аммония гидроксид (7:3) в течение 25 минут. Хроматограммы высушивали при комнатной температуре и 15 мин выдерживали при 120?С. Для обнаружения пятен на хроматограммах использовали специфический реагент - 4-диметиламинобензальдегид, избирательный к индольному кольцу триптофана, в виде 0,5 % этанолового раствора с добавлением 5 % кислоты серной концентрированной. После проявления хроматограмм способом погружения в тефлоновую кювету со свежеприготовленным раствором 4-диметиламинобензальдегид, их выдерживали в течение 5-7 минут при температуре 110?С. Сканирование пятен триптофана проводили при длине волны 625 нм на компьютерном видеоденситометре. Разработанный метод, несмотря на высокую точность определения и производительность, специфичен по отношению к триптофану .
Для анализа?-аминокислот в биологических жидкостях, лекарственных препаратах, продуктах питания широко используются методы капиллярного электрофореза, основанные на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля . Поскольку аминокислоты имеют цвиттерионный характер, они могут быть разделены с использованием буферных растворов электролитов с соответствующим значением рН, чаще всего используют нейтральные и основные разделяющие буферные растворы .
С целью повышения специфичности и чувствительности метода капиллярного электрофореза для анализа отдельных?-аминокислот используют их предварительную дериватизацию, с последующим разделением в кварцевом капилляре и спектрофотометрическим определением продуктов реакции. Так, в качестве дериватизирующих агентов используют 9-флуоренилметилформиат, 9-(2-карбазол)-этилхлорформиат, цианиновый краситель. Перспективность метода обусловлена такими его достоинствами, как экспрессность анализа, простота подготовки пробы, небольшой расход реактивов, простота аппаратурного оформления .